[發明專利]一種擴增未知序列的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒

有效

• 申請號: 201210266240.7
• 申請日: 2012-07-30
• 公開（公告）號: CN102757960A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 張紅發;任婧
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種擴增未知序列的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒。

背景技術

聚合酶鏈式反應技術（PCR）是分子生物學中的重要技術手段，但PCR技術中必須設計引物，這就需要知道目標基因的部分序列。到目前為止，絕大多數物種的基因組序列仍然未知，而且基因序列變異大，引物設計困難。人們設計出各種技術方案，檢測未知序列。其中建庫測序較準確，但操作繁雜，實驗時間長，經費高；現有的隨機引物PCR技術，雖然操作較簡單，費用較低，但是因為PCR擴增程序中退火溫度相對較低，所以擴增出的核酸目的序列特異性較差。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的隨機引物PCR技術退火溫度較低，擴增出的核酸目的序列特異性較差的缺陷，提供一種擴增未知序列的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一是：一種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列從5’端到3’端依次為：12～30個固定堿基，3～8個全簡并的堿基N和3～7個固定堿基，其中所述N為：A或G或C或T。

本發明所述寡核苷酸為本領域常規的寡核苷酸。其中所述寡核苷酸較佳地包括多聚脫氧核糖核苷酸、多聚核糖核苷酸及其他類型的多核苷酸中的一種或幾種；如嘌呤或嘧啶堿基經過修飾后的嘧啶或嘌呤堿基。“寡核苷酸”和“核酸”之間沒有長度上的區別，可以互換使用。本發明所述的寡核苷酸來源為本領域常規來源，所述寡核苷酸的來源較佳地包括人工合成寡核苷酸或從天然存在的基因組中提取獲得所述的寡核苷酸。其中所述寡核苷酸的人工合成方法較佳地包括：磷酸三酯法、磷酸二酯法、二乙基磷酸酰胺法和固相載體法中的一種或幾種。

其中所述寡核苷酸的序列優選地為：如序列表中SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。其中所述寡核苷酸中的N代表的核苷酸較佳地包括長度為3～8個全簡并堿基的核苷酸，其中所述全簡并核苷酸優選地為由6個全簡并堿基組成的核苷酸。其中所述的全簡并堿基為本領域常規的核苷酸堿基，所述全簡并核苷酸堿基較佳地包括：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶（T）。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二是：一種PCR步移擴增基因試劑盒，其中所述PCR步移擴增基因試劑盒包括如上所述的寡核苷酸、dNTP、MgCl₂、10×PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

其中所述PCR步移擴增基因試劑盒較佳地包括本領域常規PCR試劑。所述PCR試劑較佳地包括：dNTP、MgCl₂溶液、PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三是：一種PCR步移擴增基因的方法，其中所述PCR步移擴增基因的方法以前述的寡核苷酸為引物，以目標DNA為模板，所述PCR步移擴增基因的方法的反應體系包括：如前所述的寡核苷酸0.2～3μmol/L，0.2～1mmol/L?dNTP，1.5～3mmol/L的Mg²⁺，Taq?DNA聚合酶0.02～1U/μL，模板核苷酸的添加量為20～1000ng；所述PCR擴增的反應程序包括：

（1）92～95℃，變性3～6分鐘；

（2）92～94℃，變性30～45秒；

（3）52℃～64℃，退火30秒；

（4）72℃延伸2分鐘，其中步驟（2）～（4）重復30～45個循環；

（5）70～75℃延伸120～300秒；

（6）產物于4℃保存。

本發明所述的PCR步移擴增基因的方法為本領域常規使用的核酸目的序列擴增方法。所述核酸目的序列的擴增方法較佳地指聚合酶鏈式反應（PCR）。所述聚合酶鏈式反應（PCR）是指體外酶促合成核酸特異目的片段的一種方法，該方法程序較佳地包括：高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，從而使核酸目的片段得以迅速擴增。