[發明專利]一種通用型檢測漢坦病毒實時熒光RT-PCR的非診斷性方法

無效

• 申請號: 201210265437.9
• 申請日: 2012-07-27
• 公開（公告）號: CN102912035A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 楊鵬飛;胡孔新;燕清麗;姚李四;張麗萍
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明提供一種利用熒光定量RT-PCR檢測漢坦病毒的非診斷性方法。?

背景技術

漢坦病毒屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）的漢坦病毒屬（Hantavirus），為分節段的單股負鏈RNA病毒，其基因組由大（L）、中（M）和小（S）3個基因片段組成，分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn、Gc以及核蛋白。漢坦病毒的基因型別較多，截止目前已發現40多種。漢坦病毒引起人類腎綜合征出血熱和人類肺綜合征出血熱。?

隨著全球經濟一體化和貿易自由化，國外的醫學媒介生物通過先進的交通工具和國際貿易，可以迅速把傳染病從一個國家或地區傳向全球，造成國際間傳播。傳染病在國際間的廣泛傳播與流行，已成為各國政府密切關注的政治問題。《國際衛生條例》、《中華人民共和國衛生檢疫法》都對傳染病風險預警與快速決策做出了相應的規定。我國尤其是在邊境口岸應對一些未知病原的襲擊或傳入，基本不具備發現和控制的能力。這種缺陷突出表現在缺乏先進的分型技術、分子溯源技術及快速檢出技術，難于在短時間內建立正確的應對措施。這種狀況下，在我國國境口岸病原體宿主之間的交流機會加速了漢坦病毒基因組的微進化，一旦這種進化朝著有利的方向發展，很可能使缺乏普遍相應免疫力的人群感染并迅速傳播，從而引起漢坦病毒的廣泛流行。鑒于漢坦病毒流行態勢的復雜性、漢坦病毒的基因多態性、病毒寄生宿主的多樣性，使得建立一種通用檢測鑒別技術成為必要。?

目前，針對外來疫病的實驗室快速檢測技術主要采用的是免疫學檢測及核酸檢測技術，尤其是以PCR技術為代表的核酸檢測技術，能夠非常靈敏的檢測到各種疫病病原體。近年來，隨著實時熒光PCR技術的廣范應用，使得病原體的檢測得到飛速的發展。目前，尚無漢坦病毒的通用性檢測方法，基本上都是以每一種漢坦基因型別為基礎單一的擴增對應的型別。本發明擬采用實時熒光PCR技術，利用一對引物及一條探針檢測不同基因型別的漢?坦病毒，使之成為應對國內漢坦病毒型別或外來漢坦病毒型別傳入我國的有力武器，保障人民群眾的生命安全和國家的衛生安全。?

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高的檢測漢坦病毒的熒光定量PCR非診斷性方法。?

為實現上述目的，本發明一種通用型檢測漢坦病毒實時熒光RT-PCR的非診斷性方法，該非診斷性方法包括:?

（1）選擇漢坦病毒L基因全長序列，進行同源性比對，在其保守區設計引物；?

（2）根據PCR擴增區域內的核苷酸序列設計特異性探針，并檢測探針的特異性；?

（3）對待檢測物進行實時定量分析；?

其中，針對漢坦病毒L基因全長序列設計引物和探針為：?

進一步，所述引物和探針參數信息為：?

進一步，所述探針HV?Universal?Probe?L的5’端所標記熒光基團為FAM或CY3，探針3’端連接的淬滅基團為BHQ1或TAMARA。?

進一步，所述非診斷性方法包括步驟：?

1）提取待檢測樣本的RNA；?

2）實時熒光RT-PCR反應，配制一定組分濃度的25μL?PCR反應體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中;?

3）將待測樣品加入到反應體系中，進行擴增；?

4）在退火階段收集熒光信號，檢測Ct值。?

進一步，所述實時熒光RT-PCR反應的體系組分及其體積如下：?

擴增條件：?

進一步，所述實時熒光RT-PCR反應可使用的儀器為ABI實時PCR系統：7000、7300、7500或7900；BioRad實時PCR檢測系統、Stratagene定量多聚酶鏈反應儀MX4000、MX3000或MX3005。?

本發明的有益效果在于：漢坦病毒實時PCR檢測方法利用特異性熒光探針，實行完全閉管式操作，大大減少了擴增產物污染的機會、減少了實驗步驟、實驗時間和對試劑的消耗，不同于常規PCR，無需電泳鑒定。目前尚無漢坦病毒的通用性檢測方法，基本上都是以每一種漢坦基因型別為基礎單一的擴增對應的型別。本發明實現了利用一對引物及一條探針檢測不同基因型別的漢坦病毒，實時PCR具有非常高的靈敏度和特異度，對漢坦病毒基因非常靈敏、準確。在實際中，尤其是疫情爆發時有很高的應用價值。?

附圖說明