[發明專利]一種短小芽孢桿菌及其應用

無效

• 申請號: 201210264208.5
• 申請日: 2012-07-27
• 公開（公告）號: CN102757920A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 申圓圓;王文科;李春榮;王周峰
• 申請（專利權）人: 長安大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;B09C1/10;A62D3/02;C12R1/07;A62D101/20
• 代理公司: 西安創知專利事務所 61213
• 代理人: 譚文琰

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種短小芽孢桿菌及其應用。

背景技術

石油污染土壤的微生物修復技術，近十幾年來在國外得到了較大發展，但是石油烴類污染物降解速度緩慢，致使治理過程延續時間較長，一直是這項技術的一個突出難點，因此尋找高效石油降解菌是當前石油污染土壤微生物修復技術的研究熱點。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種可用于降解石油污染物的短小芽孢桿菌。該菌株是以原油為唯一碳源篩選出來的優勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種短小芽孢桿菌，其特征在于，所述短小芽孢桿菌為Bacillus?pumilus?4070，保藏編號CGMCC?No.6073，保藏日為2012年5月3日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1、該菌株具有如下的性質：

形態特征：菌落扁平較大，白色，表面微皺，直徑3mm～4mm，菌體呈直或微彎的桿菌。

生理生化特征：革蘭氏陽性細菌。

2、該菌株的篩選方法為：

步驟一、富集：將從西安市未央區長安大學渭水校區陜西省地下水與生態環境工程研究中心試驗場土壤石油污染10000mg/kg修復區10cm左右紅三葉草根際修復區采集的土樣以無菌方式稱取10.0g，接入100.0mL石油/無機鹽液體培養基中，置于28±1℃、130r/min恒溫搖床富集培養7d；然后吸取5mL培養液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養基中，再進行3次富集、馴化，每次7d；所述石油/無機鹽液體培養基的組成為：NaNO₃0.15%，(NH₄)SO₄0.15%，K₂HPO₄0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，KCl0.05%，FeSO₄·7H₂O0.001%，CaCl₂0.0002%，蒸餾水1000mL，原油（延長石油脫水原油）0.5%，以上均為質量百分比，培養基pH值7.0～7.5，105KPa滅菌20min～25min；

步驟二、篩選和純化：將步驟一中富集培養后的富集培養液按十倍稀釋法稀釋，取10^-4、10^-5、10^-63個稀釋度的培養液各0.1mL涂布于石油/無機鹽固體平板培養基上，置于37±1℃恒溫培養箱內培養48h，選取不同顏色及形態的優勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養基上進行多次劃線分離，以純化得到形態一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養基的組成為：NaNO₃0.15%，(NH₄)SO₄0.15%，K₂HPO₄0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，KCl0.05%，FeSO₄·7H₂O0.001%，CaCl₂0.0002%，瓊脂2%，蒸餾水1000mL，原油（延長石油脫水原油）0.5%，以上均為質量百分比，培養基pH值7.0～7.5，105KPa滅菌20min～25min；

步驟三、復篩：將步驟二中活化好的菌株分別接種于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%環己烷的無機鹽液體培養基中，28±1℃、130r/min搖床培養，當培養液明顯渾濁后，取lmL培養液接種到含1wt%正十二烷和1wt%環己烷的無機鹽固體培養基中培養，然后再將培養的菌株接種于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%環己烷的無機鹽液體培養基中培養，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環己烷的無機鹽液體培養基變渾濁的菌株。

3、該菌株的鑒定方法為：

步驟一、提取總DNA：