[發明專利]一種增強基因表達的ubi1內含子序列及應用

無效

• 申請號: 201210262983.7
• 申請日: 2012-07-26
• 公開（公告）號: CN102747081A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 黃大昉;郎志宏;朱莉;潘陽陽
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域：

本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種增強基因表達的ubi1內含子序列。本發明還涉及該ubi1內含子的應用。

背景技術：

大多數真核基因都被一個或多個內含子所間隔，這些間隔序列可以轉錄成pre-mRNA，這些轉錄本只有在細胞核中經剪接復合體的作用去除內含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿過核孔轉移到細胞質中進行翻譯。真核pre-mRNA的剪接是一個在細胞核中完成的、嚴格保守的化學反應，該過程包括：剪接體識別外顯子-內含子連接區段，通過兩步轉酯反應切除內含子并使相鄰的外顯子連接。

內含子雖然是基因中只被轉錄而不被翻譯的序列，但越來越多的研究發現，內含子并不是基因上的一段冗余序列，相反，內含子在基因表達方面起著重要的調控作用。這種由內含子介導的使基因表達活性增強的效應叫做內含子增強效應（intron-mediated?enhancement，IME）（Callis?et?al.，Genes?Development，1987，1:1183-1200）。真核mRNA內含子已成為提高轉基因生物外源基因表達的重要元件之一。

單子葉植物的內含子增強效應高于雙子葉植物，雙子葉植物內含子增強效應一般在2-5倍，而單子葉植物可達10-100倍（Simpson和Filipowicz,Plant?Mol.Biol.，1996，32：1-41）。雙子葉植物內含子可以提高單子葉植物基因的表達，而由于單子葉植物內含子與外顯子AU的平均含量為59%和44%，雙子葉植物的分別為74%和55%，高AU含量可以使內含子更易形成莖環結構從而有利于剪接，因此，單子葉植物內含子通常不會提高雙子葉植物基因的表達（Vain?et?al.，Plant?cell?Rep,1996,15:489-494）。Ueki等將PLD、Cat和Ubi（玉米ubiquitin第一個內含子）內含子與不同啟動子連接，分別轉化玉米和煙草的原生質體，驗證各個載體表達特點，結果發現，含有內含子載體的報告基因表達水平在玉米原生質體中普遍高于同樣載體的煙草原生質體的表達水平，內含子載體增強效應與啟動子、內含子和報告基因等緊密相關（Ueki?et?al.，Plant?Biotech，2004，21(1)：15-24）。

泛素(ubiquitin)是一種存在于大多數真核細胞中的由76個氨基酸殘基組成的高度保守的蛋白質。1992年，Christensen等從玉米中克隆出了編碼泛素蛋白的Ubi-1和Ubi-2基因，并準確定位了Ubi-1的啟動子、轉錄起始位點、5’側翼序列處的0.9kb轉錄調控區和完整的5’非編碼區，并構建pUBI-CAT載體，在玉米和其它單子葉植物的原生質體中進行驗證，發現Ubi-1啟動子比CaMV35S具有更高的增強基因表達的效應(Christensen?et?al.,Plant?Mol?Biol，1992，18：675-689)。

Vain等通過比較發現，ubi1內含子與側翼外顯子的41nt所構建的載體（p35SubiGUS）在玉米懸浮細胞中的增強效應高于其它載體，增強效應可提高71倍(Vain?et?al.,Plant?cell?Rep，1996，15：489-494）。王悅冰比較了玉米泛素蛋白基因的第一內含子（ubi1）、水稻肌動蛋白基因的第一內含子（act1）、玉米乙醇脫氫酶基因的第一內含子(adh1)和馬鈴薯高賴氨酸基因SBgLR基因的第二內含子(SBgLR2)對基因表達的增強作用，結果發現ubi1增強報告基因的表達能力最強；盡管已知并不是內含子中所有序列為提高基因表達所必需，但尚未見到有關通過缺失分析對ubi1內含子改造研究的報道。

發明內容：

本發明的目的是對來源于玉米泛素蛋白基因ubi1內含子進行缺失分析，提供一種可以增強基因表達的內含子，通過構建該改造的泛素蛋白內含子的植物表達載體，將其應用于轉基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉基因植物中的表達。

本發明通過如下工作達到了上述發明目的：

1、內含子缺失載體的構建策略

本發明以ubiquitin基因第一內含子序列（SEQ?ID?NO:1）為目標序列。在此序列中，有下劃線部分表示缺失備選位點。

SEQ?ID?NO:1

1??GTACGCCGCT?CGTCCTCCCC?CCCCCCCCCT?CTCTACCTTC?TCTAGATCGG?CGTTCCGGTC