[發(fā)明專利]乙型肝炎病毒HBx基因的人工轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210262461.7
• 申請日: 2012-07-27
• 公開（公告）號: CN102816214A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳薇;趙興卉;黃培堂;朱旭東;周曉巍;徐俊杰;付玲
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K19/00;C12N9/22;C12N9/10;C12N9/90;A61K38/16;A61K38/46;A61K38/45;A61K38/52;A61P31/20
• 代理公司: 北京市頤合律師事務(wù)所 11383
• 代理人: 李新軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鋅指蛋白及其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控目標(biāo)基因方面的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular?carcinoma，HCC)是全世界最常見的癌癥之一，而慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC最重要的危險(xiǎn)因子之一，研究表明，HBV攜帶者的HCC發(fā)生率比非攜帶者高5-15倍。大約85-90％的HBV陽性HCC病例在肝細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有HBV的整合片段，而X基因是HCC病人中整合最頻繁的HBV片段。X基因(以下簡稱HBx)是HBV的一個(gè)ORF，其蛋白產(chǎn)物稱為HbxAg，通常由154個(gè)氨基酸組成。目前發(fā)現(xiàn)HBx在HBV感染宿主以后會與細(xì)胞中的一些因子發(fā)生作用，并可能在HBV誘發(fā)宿主產(chǎn)生HCC(原發(fā)性肝細(xì)胞癌)的過程中起到某種調(diào)控作用。1991年美日學(xué)者將1.5kb的含HBx基因的片段注入小鼠受精卵內(nèi)，得到的小鼠最后都發(fā)展為HCC，表達(dá)HbxAg和AFP，而在小鼠生前ALT一直正常。說明肝細(xì)胞單純表達(dá)HBx，無需產(chǎn)生細(xì)胞損傷即可造成形態(tài)和生化改變，最終也會導(dǎo)致HCC。根據(jù)基于一項(xiàng)CD1品系的HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，80-91％的雄性HBx轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生HCC，并于11-15個(gè)月齡時(shí)死于HCC；60-67％雌性HBx轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生HCC，并于12-21個(gè)月齡時(shí)死于HCC；而野生型CD1小鼠未見原發(fā)肝部腫瘤。HBx基因?qū)τ贖BV自身基因組的復(fù)制是必需的，并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)蛋白功能，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)降解和DNA修復(fù)等多方面，并在腫瘤晚期還參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移與血管生成相關(guān)的宿主基因的調(diào)控，因此，被認(rèn)為是一種HBV來源的HCC相關(guān)的癌基因。靶向并特異地下調(diào)HBx被認(rèn)為是阻斷HBV感染相關(guān)的HCC的有效方法，目前研究者已經(jīng)嘗試了核酶、反義核酸，以及siRNA等方法人工干預(yù)下調(diào)HBx表達(dá)，但由于這些方法受核酸分子半衰期的限制，且容易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，因此仍需要開發(fā)出特異的調(diào)控HBx表達(dá)的方法。

人工轉(zhuǎn)錄因子是通過識別DNA位點(diǎn)，對基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，因此利用少量的人工轉(zhuǎn)錄因子往往就能起到很好的調(diào)控效果。有研究表明合理設(shè)計(jì)的人工轉(zhuǎn)錄因子能夠針對抑癌基因、原癌基因以及病毒的轉(zhuǎn)錄都起到相應(yīng)的調(diào)控作用，一個(gè)合適的人工轉(zhuǎn)錄因子甚至可以調(diào)節(jié)某個(gè)基因家族或是整條代謝通路中的一系列相關(guān)產(chǎn)物，因此人工轉(zhuǎn)錄因子在疾病的基因治療與抗病毒治療等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。另外，由于人工轉(zhuǎn)錄因子可以進(jìn)行模塊化設(shè)計(jì)，通過改變DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以靈活選擇其作用靶位，改變其功能結(jié)構(gòu)域則可以對于目的基因進(jìn)行激活、抑制、甲基化等不同的調(diào)控，應(yīng)用十分靈活方便。人們借鑒人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建思路，利用更為多樣的功能結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了許多能夠特異地作用于靶序列的新型蛋白，用于對DNA進(jìn)行某種定點(diǎn)的操作。例如，將限制性內(nèi)切酶的切割亞基與序列特異的鋅指相連，構(gòu)建人工核酸酶，從而能夠任意地切割目的序列，并提高重組的效率。把DNA甲基化酶與鋅指相連，構(gòu)建人工甲基化酶，可以在目的啟動子上引入甲基化，使得目的基因表達(dá)沉默。此外，Bushman等將HIV-1的整合酶結(jié)構(gòu)域與鋅指相連構(gòu)建了嵌合的整合酶；Beretta等利用相似的方法構(gòu)建了序列特異的拓?fù)洚悩?gòu)酶。有時(shí)候人工甲基化酶等也被統(tǒng)稱為人工轉(zhuǎn)錄因子，但人們更習(xí)慣將它們稱為嵌合酶。

人工轉(zhuǎn)錄因子含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)功能域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)特異性識別和結(jié)合DNA靶序列，而效應(yīng)功能域則負(fù)責(zé)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，即上調(diào)或下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄。C₂H₂鋅指結(jié)構(gòu)是Miller等在1985最先在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中發(fā)現(xiàn)的，是真核細(xì)胞中最常見的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在人類基因組中，大約有2％的基因編碼C₂H₂鋅指結(jié)構(gòu)。每一個(gè)C₂H₂鋅指單元由大約30個(gè)氨基酸組成，形成反平行的β折疊片與一個(gè)α螺旋(α-helix)，通過疏水作用以及其中的2個(gè)Cys殘基和2個(gè)His殘基與一個(gè)Zn²⁺離子的作用來穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，形狀類似與人的手指，“鋅指”因此而得名。