[發明專利]大腸癌特異性抗原肽及大腸癌檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210260938.8
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN102796191A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 曹廣文;傅傳剛;常文軍;吳玲玲;曹付傲;劉巖;高顯華;李小攀
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/63;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/543
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

本申請是中國專利申請號為201010275415.1、申請日為2010年9月7日、發明名稱“大腸癌特異性抗原肽及大腸癌檢測試劑盒”的分案申請。

技術領域

本發明涉及醫用檢測試劑技術領域，涉及一種大腸癌特異性抗原肽的表達載體及構建方法、大腸癌特異性自身抗體酶聯免疫檢測試劑盒及操作方法。

背景技術

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其全球發病率位于第三，在我國則有逐年上升的趨勢，在上海已位居惡性腫瘤發病率第二位。根據中國衛生部衛生信息2007年統計數據表明，發病率占全部惡性腫瘤的第3位，大腸癌死亡率為10.25／10萬，占癌癥致死第5位。大腸癌根據TNM分期不同可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，各期大腸癌預后相差很大，早期大腸癌復發及轉移率低，預后良好，術后5年生存率可達97%，進展期大腸癌術后5年生存率僅為40%-50%。因此探索大腸癌早期診斷和篩查方法非常重要。

目前常用的大腸癌檢查方法有直腸指診、糞便隱血實驗、結腸鏡及影像學檢查。而這些檢查都存在有不足之處，直腸指診范圍局限，糞隱血實驗敏感性及特異性差，結腸鏡檢查有一定痛苦，患者較難接受，影像學檢查對于早期腫瘤不敏感。目前常用的腫瘤標志物如癌胚抗原（CEA），CA19-9等指標缺乏敏感性及特異性，不能對大腸癌進行早期診斷。因此建立能高通量診斷大腸癌的特異檢查方法是當務之急。

發明內容

腫瘤發生后，腫瘤細胞表面的特征抗原或腫瘤細胞分泌的特征抗原刺激機體產生抗體，這些抗體可存在于尚無癥狀的早期腫瘤患者血清中。通過尋找大腸癌特征抗原，利用它來檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而做為分子標志，可以早期發現大腸癌,與現行的其他方法相比,具有微創、簡單、經濟、敏感度及特異度高等特點,方便用于社區人群的篩查,從而達到早期檢測大腸癌的目的。

本發明的第一個目的在于提供一種大腸癌特異性抗原肽，利用它來檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而作為分子標志來早期發現大腸癌。

本發明的第二個目的在于提供一種大腸癌特異性抗原肽的表達載體。

本發明的第三個目的在于提供該表達載體的構建方法。

本發明的第四個目的在于提供包含表達載體的大腸癌特異性自身抗體酶聯免疫檢測試劑盒，用于檢測早期大腸癌。

本發明的第五個目的在于提供該試劑盒的制備及其操作方法。

本發明提供的大腸癌特異性抗原肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.8，或SEQ?ID?No.10所示。

本發明提供的大腸癌特異性抗原肽的表達載體，由噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構成，所述cDNA片段的序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.7或SEQ?ID?No.9所示。優選的，所述噬菌體為T7噬菌體。

本發明提供的大腸癌特異性抗原肽表達載體的構建方法，包括：

a）構建大腸癌噬菌體展示肽庫：

抽提30例新鮮大腸癌組織總RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，應用oligo?dT引物反轉錄為cDNA，將cDNA末端進行平齊，加EcolⅠ和Hind?III接頭，雙酶切后去除小片斷，然后接入T7噬菌體雙臂，進行體外包裝，構建大腸癌噬菌體展示肽庫；

b）親和篩選大腸癌特異抗原肽：

取10μl?A/G的瓊脂糖珠置于一1.5ml離心管中，用pH7.4的500μl?PBS洗2次，1%BSA4℃封閉1h，瓊脂糖珠分別與15μl大腸癌患者及對照患者的血漿4℃孵育過夜，500μl?PBS洗滌3次后，用10μl?PBS溶解富集到的抗體，10管大腸癌的抗體及10管非大腸癌的抗體各自合并成一管，取所述噬菌體展示肽庫擴增液20μl，先與20μl的非大腸癌抗體孵育1h，未結合的上清再與20μl大腸癌抗體結合，保留結合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并用100μl?1%SDS洗脫，將其轉染細菌至擴增，完成一輪親和篩選，重復上述步驟，反復進行五輪親和篩選；

c）血清學篩選大腸癌早期檢測分子標志：

c1）混合血樣初篩：