[發(fā)明專利]一種丁二酸酐化學修飾提高枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶穩(wěn)定性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210260550.8
• 申請日: 2012-07-26
• 公開（公告）號: CN102747064A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設計）人: 田亞平;張靜
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種丁二酸酐化學修飾提高枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶穩(wěn)定性的方法，屬于酶制劑、食品添加劑技術領域。

背景技術

氨肽酶是一類從蛋白質(zhì)或肽鏈的N端酶切氨基酸殘基的外肽酶的總稱。它在蛋白水解產(chǎn)品的制備中可作為組合復配用酶，起脫苦、深度水解，制備多功能活性肽等作用，還可作為N端測序工具酶和醫(yī)療診斷用酶。

酶作為一種生物催化劑，因其半衰期短、易失活等缺點嚴重影響著酶的使用效果。酶的穩(wěn)定性是指酶分子抵抗各種不同因素影響，維持一定空間結(jié)構(gòu)，保持催化活性相對穩(wěn)定的能力，包括熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、抗氧化性和耐有機溶劑等方面。氨肽酶作為一種工業(yè)化酶制劑，其熱穩(wěn)定性是一個很關鍵的因素。酶的熱穩(wěn)定性提高具有明顯的優(yōu)勢，延長酶的儲存時間、減少在運輸過程中的酶活損失，使酶在較高反應溫度下延長酶的反應時間，提高生產(chǎn)效率，有效的降低生產(chǎn)成本。所以，如何提高酶的穩(wěn)定性，從而擴大酶的應用范圍的研究越來越引起人們的重視。

目前，提高酶穩(wěn)定性的策略主要從酶分子改造和微環(huán)境改良兩方面入手。酶分子改造包括定點突變、化學修飾以及酶固定化等方法；微環(huán)境改良包括添加保護劑、防腐劑、蛋白酶抑制劑、抗氧化劑和還原劑等。其中化學修飾是提高和改善酶催化性能的有效方法之一。酶的化學修飾，就是利用某些專一性化學試劑處理酶蛋白，使之與酶蛋白分子中的特定氨基酸殘基反應，改變這些氨基酸殘基側(cè)鏈的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，從而改變活性中心原有的空間構(gòu)象，或改變酶的輔因子的成分，進而改變酶原有的特性。酶的化學修飾在改變酶的專一性、穩(wěn)定性、提高藥用酶的半衰期消除免疫原性，甚至改變酶的催化反應類型等方面都已取得了重大進展。

氨肽酶分子上的Lys殘基末端的ε-NH₂由于具有較強的親核性，可與小分子化學修飾劑丁二酸酐反應，從而改變酶分子的電荷以及結(jié)構(gòu)，進而使酶的性質(zhì)得到改善。對推動該酶今后的工業(yè)化生產(chǎn)和進一步的應用有積極的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是用丁二酸酐在經(jīng)優(yōu)化后的最佳修飾條件下對氨肽酶進行化學修飾，提供一種丁二酸酐化學修飾提高枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶穩(wěn)定性的方法，顯著提高了氨肽酶的熱穩(wěn)定性，修飾后酶對底物的親和力也有所增加，同時伴隨了一系列的酶學特性表征方面的變化。

本發(fā)明的技術方案：

枯草芽孢桿菌Zj016的發(fā)酵液冷凍離心、澄清、超濾濃縮、脫鹽、冷凍干燥，得食品級固體氨肽酶（中國專利201010578579.1已公開，公開號CN102078012A，公開日2011-6-1），在最佳化學修飾條件下，用丁二酸酐對所得的氨肽酶進行化學修飾，得到修飾酶，主要以酶活保留率和相對酶活力為依據(jù)，得到一種丁二酸酐化學修飾提高枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶穩(wěn)定性的方法，其工藝為：

A、丁二酸酐對氨肽酶的化學修飾方法

通過單因素實驗考查了修飾反應pH、修飾反應時間、修飾反應溫度、修飾劑與酶的質(zhì)量比這四個因素對化學修飾反應的影響，以酶活保留率為指標，得出最佳的化學修飾條件：

（1）稱取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl緩沖液中，然后向混合液中緩慢加入10mg的丁二酸酐（SA），攪拌溶解，在整個反應過程中用2mol/L?NaOH溶液維持反應體系的pH值為8.0，在4℃條件下反應1h，反應結(jié)束后，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl緩沖液在4℃透析過夜，以除去多余的修飾劑，得到丁二酸酐修飾的氨肽酶（修飾酶液SA-AE），4℃冰箱保存；

（2）稱取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl緩沖液中，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl緩沖液在4℃透析過夜，得到原酶液（AE），4℃冰箱保存。

B、修飾前后酶的部分酶學性質(zhì)

（1）采用丁二酸酐對氨肽酶在優(yōu)化條件下進行化學修飾，SA對AE的平均氨基修飾率為55.86%，酶活保留率為105.81%。

（2）動力學參數(shù)Km的測定

以L-亮氨酸-4-硝基苯胺為底物，在原酶和修飾酶的最佳酶活測定的條件下，測定底物濃度為0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L時原酶和修飾酶的酶活。按照Lineweaver-Burk作圖法取雙倒數(shù)作1/v-1/s曲線，計算原酶和修飾酶的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vm。