[發明專利]密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因

無效

• 申請號: 201210260491.4
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN102827848A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 王伯初;婁德帥;譚君;祝連彩;季慶治;岑小惜;劉紹勇
• 申請（專利權）人: 上海凱寶藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種按大腸桿菌密碼子偏愛性優化的的7α-羥基類固醇脫氫酶（7α-HSDH）基因。

背景技術

熊膽是名貴的中藥材，用于治療膽結石疾病以及各種急性、慢性肝病，具有良好的治療效果。熊去氧膽酸(3α-7β-二羥基-5β-膽烷酸，以下簡稱UDCA)以及牛磺/甘氨熊去氧膽酸（T/GUDCA）是中藥材熊膽的主要有效成份。然而，由于中藥熊膽粉主要的獲取方式為“活熊引流取膽”，這有違野生動物保護法。并且被認為是非常不人道的獲取方式。另外，化學合成法過程復雜、得率較低。然而動物膽汁中存在眾多膽酸類物質，如牛、羊膽酸、鵝去氧膽酸、熊膽酸、豬膽酸、豬去氧膽酸等，這些物質可以通過適當的生物培育轉化成UDCA及其衍生物，其中在雞膽汁中鵝去氧膽酸（CDCA）以及牛磺/甘氨鵝去氧膽酸（T/GCDCA）含量豐富。CDCA與UDCA的差別僅在于7位羥基的差向異構，利用7α、7β-羥基類固醇脫氫酶（7α、7β-HSDH）可以將CDCA、T/GCDCA轉化為UDCA、T/GUDCA。來自撒丁島梭菌（Clostridium?sardiniense，DSM599/ATCC27555）的7α、7β-HSDH酶可以實現上述轉化過程。

因此，為了快速獲取大量的和高純度的7α-HSDH酶，本發明提出通過密碼子優化的7α-HSDH酶基因在大腸桿菌中進行原核表達。原核表達在短時間內可以得到大量產物，而為了得到有活性、結構完整的目的蛋白，分析基因中使用頻率較低的密碼子并進行替換從而得到優化的基因序列是十分必要的。另外，原核表達時采用原核表達載體pGEX-6p-1與目的基因進行GST融合表達，得到的融合表達蛋白往往具有正確的空間結構和相應的酶活，并且GST融合蛋白純化方法簡單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。

發明內容

鑒于此，本發明的目的之一是提供密碼子經過改造且mRNA二級結構穩定的密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。該優化基因在不改變蛋白質氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，按照大腸桿菌的偏愛性進行優化，使其在宿主細胞中的表達量和純度顯著提高；

本發明的目的之二是提供含密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達載體pGEX-6p-1-7α-HSDH；

本發明的目的之三是提供含密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達載體的大腸桿菌。

本發明采用密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達載體pGEX-6p-1在大腸桿菌中GST融合表達，在短時間內可以生成大量有活性、結構完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。

附圖說明

圖1為本發明優化前后7α-HSDH基因序列比較

圖2A為本發明7α-HSDH基因優化前表達的7α-羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2B為本發明7α-HSDH基因優化后表達的7α-羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖3為本發明不同pH條件下優化的7α-HSDH催化CDCA氧化的酶活比較

具體實施方式

下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍。本發明不限于下述實施方式或實施例，凡不違背本發明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發明范圍之內。

實施例1：7α-羥基類固醇脫氫酶基因的優化設計和合成

稀有密碼子的分析：稀有密碼子主要通過軟件E.coli?Codon?Usage?Analysis2.0（Morris?Maduro，參考：Analysis?and?Predictions?from?Escherichia?coli?sequences?in:Escherichia?coli?and?Salmonella,Vol.2,Ch.114:2047-2066,1996,Neidhardt?FC?ed.,ASM?press,Washington,D.C.）分析得到在大腸桿菌中的使用相對頻率低于閾值（10‰）的密碼子。

優化稀有密碼子：根據不同密碼子在大腸桿菌中的使用頻率將使用頻率低于閾值的密碼子進行優化。優化結果如下：

本發明所用的優化密碼子