[發明專利]食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑篩選平臺的建立

無效

• 申請號: 201210260320.1
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN102766674A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 夏遠峰;張玉珂;秦旭釗;陳景才
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑篩選平臺的建立，其特征在于，包括以下步驟：

A、在384孔板里每孔植入1.5萬個中國倉鼠卵巢細胞的陽性克隆細胞，在37℃、5％二氧化碳氛圍的培養箱里培養16-24小時；

B、棄去培養基，200轉/分離心10秒去除殘留培養基，每孔加入30微升鈣離子檢測染料，在37℃、5％二氧化碳氛圍的培養箱里培養90分鐘；

C、用鈣離子檢測緩沖液配制4X的激動劑d[Cha4]-AVP和1X的待測藥物；

D、細胞孵育90分鐘后，棄去鈣離子檢測染料，200轉/分離心10秒去除殘留染料；

E、每孔加入30微升1X的待測藥物，25℃孵育15分鐘，然后每孔再加入10微升4X的激動劑d[Cha4]-AVP；

F、在室溫下用酶標儀檢測，能夠抑制激動劑引起的鈣離子釋放的藥物為食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑。

2.根據權利要求書1所述的食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑篩選平臺的建立，其特征在于：所述的中國倉鼠卵巢細胞的陽性克隆細胞按以下步驟制備：

一、質粒轉染

A、在6孔板里，每孔植入兩百萬個中國倉鼠卵巢細胞，用F12/10％胎牛血清的培養基培養16-24小時；

B、稀釋5微升脂質體到125微升OptiMEM?I低血清培養基，溫和混勻，室溫放置5分鐘；稀釋2微克食蟹猴抗利尿激素受體克隆質粒到125微升OptiMEM?I低血清培養基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；將上述兩者溫和混勻，室溫放置30分鐘后，加入6孔板中，輕輕混勻；

C、在37℃、5％二氧化碳氛圍的培養箱里培養24小時后，形成轉染體以備篩選；

二、克隆篩選

D、將F12/10％胎牛血清的培養基培養過夜，將轉染體分別稀釋成1∶20、1∶40和1∶80濃度，分別加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培養過夜的培養基培養；

E、接下來2周內每天更換培養基，直到沒有轉染質粒的細胞全部死亡后，進行克隆挑選，挑選出克隆的穩定表達食蟹猴抗利尿激素受體細胞進行下一步驟；

三、用酶標儀篩選陽性克隆細胞

F、將挑選出的克隆細胞以5萬個細胞/孔的濃度植入96孔板中，在37℃、5％二氧化碳氛圍的培養箱里培養過夜，然后棄去培養基，每孔加入100微升鈣離子檢測染料，在37℃、5％二氧化碳氛圍的培養箱里培養90分鐘；

G、準備濃度為1.5微摩的激動劑d[Cha4]-AVP，每孔加入25微升激動劑；

H、用酶標儀檢測克隆細胞的鈣離子水平，激動劑能夠有效刺激鈣離子水平提高的克隆細胞為陽性克隆細胞。