[發(fā)明專利]可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210259171.7
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN102766633A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王柯敏;郭秋平;劉小丹;羊小海;譚譽(yù)宇
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種核酸適配體及其篩選和應(yīng)用，尤其涉及一種可用于檢測人肝癌細(xì)胞的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

核酸適體（aptamer）是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選得到的，能特異結(jié)合靶物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。核酸適體與抗體功能類似，但是與抗體相比具有更多的優(yōu)勢，具有更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠化學(xué)合成，成本低；可進(jìn)行標(biāo)記；穩(wěn)定性好，易于保存等優(yōu)點(diǎn)。核酸適體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)，并從單一靶標(biāo)擴(kuò)展至完整的病毒顆粒及細(xì)胞等復(fù)合物靶標(biāo)。因此，核酸適體具有廣泛的應(yīng)用前景。

肝癌是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第五位。對于惡性腫瘤而言，如果能及早發(fā)現(xiàn)、盡早治療，則癌癥的病情往往容易得到控制，降低肝癌發(fā)病引起的死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)一種更加靈敏、簡便、高效和具有特異性的肝癌檢測手段，對于肝癌的臨床治療將具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學(xué)合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標(biāo)記的可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體及其衍生物，還提供前述核酸適體的篩選方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下序列1～序列4中的任意一條序列所示的DNA片段：

序列1：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGA

CGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；

序列2：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACG

GGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；

序列3：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGT

CATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；

序列4：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGT

CATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。

上述的可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列上的某一位置可優(yōu)選被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。

上述的可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列上優(yōu)選結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記。

以上不論是經(jīng)部分取代或者經(jīng)過修飾后的核苷酸序列，都具有原核酸適體基本相同的性質(zhì)和功能，即都可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種：

（1）與上述所列核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上；

（2）與上述所列核酸適體的核苷酸序列進(jìn)行雜交的序列；或者

（3）上述所列核酸適體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404的核酸適體衍生物，所述衍生物是上述所列核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。

以上不論是衍生出的核酸適體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適體基本相同的性質(zhì)和功能，即都可用于檢測人肝癌細(xì)胞株Bel-7404。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟：

（1）合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物：

隨機(jī)文庫RS40：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N)TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA

5’引物：5’-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’

3’引物：5’-Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’；