[發(fā)明專利]一株鹽單胞菌多基因敲除株的構(gòu)建和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210258589.6
• 申請(qǐng)日: 2012-07-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102816729A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳國(guó)強(qiáng);譚丹;李騰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12P7/62;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

1.一種重組菌，是對(duì)生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌進(jìn)行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為失活所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因；所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)?-甲基檸檬酸合成酶編碼基因、PHA降解酶1編碼基因、PHA降解酶2編碼基因和PHA降解酶3編碼基因中的至少一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于：

所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌為Halomonas?sp.TD01，保藏號(hào)為CGMCCNo.4353。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于：

所述失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)閯h除各種所述基因的全部編碼框。

4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述重組菌的方法，包括如下步驟：失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因，得到的重組菌；

所述失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因具體通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述同源重組包括如下步驟：

1）將含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自殺質(zhì)粒中，得到重組自殺質(zhì)粒；

所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌基因組中待敲除基因的上下游兩條同源臂組成；

2）將所述重組自殺質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌中，得到同源重組菌1；

3）將誘導(dǎo)質(zhì)粒導(dǎo)入所述同源重組菌1中，即得到所述重組菌。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于：

在上述方法的步驟3）中，還包括將誘導(dǎo)質(zhì)粒導(dǎo)入所述同源重組菌1中得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行阿拉伯糖誘導(dǎo)，得到所述重組菌的步驟；

所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌為Halomonas?sp.TD01，保藏號(hào)為CGMCCNo.4353；

所述自殺質(zhì)粒為帶有6個(gè)I-SceI位點(diǎn)的自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI；

所述誘導(dǎo)質(zhì)粒為表達(dá)歸位內(nèi)切酶I-SceI的質(zhì)粒pMCS1-Spe-araC-ISceI。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述同源重組中，步驟1）的所述待敲除基因?yàn)?-甲基檸檬酸合成酶編碼基因，步驟2）的出發(fā)菌為所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌，步驟3）得到重組菌A。

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述同源重組中，步驟1）的所述待敲除基因?yàn)镻HA降解酶1編碼基因，步驟2）的出發(fā)菌為所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌，步驟3）得到重組菌B。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：對(duì)所述重組菌B進(jìn)行權(quán)利要求5或6所述的方法中的同源重組，步驟1）的所述待敲除基因?yàn)镻HA降解酶2編碼基因，步驟2）的出發(fā)菌為所述重組菌B，步驟3）得到重組菌C。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：對(duì)所述重組菌C進(jìn)行權(quán)利要求5或6所述的方法中的同源重組，步驟1）的所述待敲除基因?yàn)镻HA降解酶3編碼基因，步驟2）的出發(fā)菌為所述重組菌C，步驟3）得到重組菌D。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于：對(duì)所述重組菌D進(jìn)行權(quán)利要求5或6所述的方法中的同源重組，步驟1）的所述待敲除基因?yàn)?-甲基檸檬酸合成酶編碼基因，步驟2）的出發(fā)菌為所述重組菌D，步驟3）得到重組菌E。

12.權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌在制備聚羥基丁酸戊酸共聚酯中的應(yīng)用。

13.權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌在提高聚羥基丁酸戊酸共聚酯中3-羥基戊酸單體所占的摩爾百分比中的應(yīng)用。

14.一種制備聚羥基丁酸戊酸共聚酯的方法，包括如下步驟：在含有丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌，收集菌體，即得到聚羥基丁酸戊酸共聚酯。

15.權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的丙酸終濃度為0.5g/L-1g/L，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的丙酸終濃度具體為0.5g/L。

16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于：

所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有氯化鈉，所述氯化鈉的濃度為250g/L以下，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度具體為60g/L。