[發(fā)明專利]單分子力譜分析用AFM探針和基底功能化修飾方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210258572.0
• 申請(qǐng)日: 2012-07-24
• 公開（公告）號(hào): CN103575934A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘建;馬夢(mèng)佳;魏岱旭;閆志強(qiáng);周涓;李文英;何丹農(nóng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司
• 主分類號(hào): G01Q60/38
• 分類號(hào): G01Q60/38;G01Q60/24
• 代理公司: 上海東方易知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 31121
• 代理人: 唐莉莎

1.一種單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一步：在氯仿中清洗針尖鍍金的原子力顯微鏡探針和金基底，探針和金基底，在氮?dú)庀赂稍?，紫外臭氧清洗，隨后用超純水清洗，氯仿清洗，氮?dú)庀赂稍铮?/p>

第二步：將清洗干凈的金探針和金基底放入到氯仿為溶劑的氨基甲酸叔丁酯–聚乙二醇–巰基（Boc-PEG-3000-SH）和甲氧基–聚乙二醇–巰基（mPEG-2000-SH）混合液中避光反應(yīng)；

第三步：在蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基乙酸酯?（SATA），或N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），并反應(yīng)一段時(shí)間；

第四步：在第三步得到的蛋白溶液中，加入脫乙酰緩沖液中反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為0.5?～3小時(shí)，隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽；

第五步：取第二步得到的金探針和金基底放入到三氟乙酸中，超純水清洗；

第六步：金探針和金基底放入到交聯(lián)劑4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC），或4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC）溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間，超純水清洗；

第七步：金探針和金基底置入到第四步處理得到的蛋白溶液，反應(yīng)，超純水清洗，置入磷酸鹽（PBS）緩沖液中4度保存?zhèn)溆谩?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，所述原子力顯微鏡探針的針尖表面已經(jīng)鍍了一層金膜作為功能化修飾的基底。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，第二步所述聚乙二醇混合液中Boc-PEG-3000-SH摩爾比率為0.5～10﹪，總聚乙二醇濃度為1～10mM，反應(yīng)時(shí)間為12～24小時(shí)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，第三步所述蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基乙酸酯，或N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯先溶解于二甲基甲酰胺，或二甲基亞砜，隨后再加入到蛋白溶液中，其與蛋白的摩爾比為10：1～250：1，反應(yīng)時(shí)間為0.5?～3小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，第四步所述脫乙酰緩沖液為0.5M羥胺，25mM?乙二胺四乙酸（EDTA），PBS緩沖體系，pH為7.2～7.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，第五步所述三氟乙酸反應(yīng)時(shí)間為5～10分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，第六步所述交聯(lián)劑4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC），或4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC）先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超純水中，隨后再將SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS緩沖體系中，濃度為0.1～2?mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為15～45分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述單分子力譜分析用原子力顯微鏡探針和基底功能化修飾方法，其特征在于，第七步所述蛋白濃度為1～20μg/mL，反應(yīng)的量為50～300μL，反應(yīng)時(shí)間為0.5～3小時(shí)。