[發明專利]影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動子及其功能性分子標記與應用

無效

• 申請號: 201210257692.9
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN102899396A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 黃金明;王秀革;李黎明;鞠志花;齊超;張燕;李秋玲;王長法;李榮嶺;杭蘇琴;侯明海;高運東;仲躋峰
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113;C12N15/11
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1.一種改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于：通過反轉錄RT-PCR和實時熒光定量RT-qPCR的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，同時為了深入研究HMGB3兩個轉錄本的表達調控模式，利用在線軟件分析發現牛HMGB3基因共有3個啟動子區：P1、P2和P3，進一步通過構建載體、細胞轉染、啟動子活性測定和熒光強度測定實驗發現了牛HMGB3基因3個啟動子的核心區域，并且在第3個啟動子P3的核心區域內發現了一個SNP，構建EGFP-HMGB3-P3載體，經293T細胞轉染后，發現該SNP位點可影響啟動子P3活性，屬于功能性位點，利用該SNP與奶牛乳中體細胞評分SCS的關聯分析表明該SNP與奶牛乳腺炎有關，選擇有利的等位基因型個體留種，從而改善種群奶牛的抗乳腺炎能力。

2.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動子區的鑒定方法，其特征在于通過實時反轉錄RT-PCR和熒光定量RT-qPCR的方法發現目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺組織中mRNA存在差異表達；構建不同長度片段的pGL3-basic-HMGB3雙熒光素酶報告基因載體，以及具有野生型和突變型堿基的pEGFP-N1-HMGB3載體，分別轉染293T細胞，確定牛HMGB3基因的核心啟動子區；通過對牛HMGB3基因核心啟動子區進行直接測序分析，在HMGB3基因的第3啟動子P3內發現一個單核苷酸突變g.+2690C＞T，它位于潛在的轉錄因子結合位點上，可影響啟動子P3的轉錄活性；通過奶牛群體基因型和乳中體細胞評分的關聯分析，證明這個位點為功能性位點，且與奶牛乳腺炎相關。

3.一種實現影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動子區的鑒定以及利用該鑒定改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于該方法的步驟是：

a、篩選HMGB3基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因

a.a?RT-PCR檢測HMGB3基因兩個轉錄本在不同組織中的表達

提取患乳腺炎奶牛的乳腺組織樣品和正常牛的不同組織樣品的mRNA，反轉錄后用來分析HMGB3mRNA的相應組織的表達量，

利用RT-PCR定量的結果，反映轉錄本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各組織中的表達情況，來確定HMGB3基因與奶牛乳腺炎的關系；

a.b熒光定量RT-qPCR檢測HMGB3基因在乳腺組織中的表達

為了進一步分析HMGB3的表達量和奶牛乳腺炎的關系，分別選擇正常的和患乳腺炎的乳腺組織進行RT-qPCR，相對表達水平用管家基因β-actin做內參，每個樣品重復實驗，

分析熒光定量RT-qPCR的結果，比較患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達量和其在正常奶牛乳腺組織的表達量；結果表明，患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達顯著高于其在正常奶牛乳腺組織的表達；

b、牛HMGB3基因啟動子P1、P2、P3的克隆和活性分析

生物信息學genomatix軟件預測發現牛HMGB3基因有3個啟動子，為了進一步驗證這3個啟動子是否具有啟動子活性，而且確定其核心啟動子區，利用序列遞減的方法對P1和P2啟動子區不同片段構建入pGL3-basic載體并且轉染293T細胞，進行雙熒光素酶報告基因分析其不同片段的啟動子活性，根據NCBI的牛HMGB3基因參考序列，構建pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4和pGL3-5載體驗證分析HMGB3-P1啟動子，構建pGL3-C-1和pGL3-C-2載體分析P2啟動子，最終實驗驗證發現HMGB3基因的P1啟動子核心區位于g.-655-g.-114，牛HMGB3基因的P2啟動子核心區位于g.-116-g.+301區域；

c、HMGB3基因P3啟動子區功能性SNP位點的鑒別

設計引物HMGB3F：SEQ?ID?NO.3和HMGB3R：SEQ?ID?NO.4擴增HMGB3啟動子P3區，通過對DNA直接測序的方法，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測序結果，在P1和P2啟動子區未發現SNP位點，但是在P3啟動子區內發現了1個SNP位點，即在擴增片段的第454位發生堿基C＞T突變，根據國際通用的SNP命名和編碼規則，該SNP突變命名為g.+2690C＞T，由于這個突變的引入消除了限制性內切核酸酶Sac?II的結合位點，因此，Sac?II限制性內切酶可將具有不同突變的PCR產物切成長度不同的片段，經2％的凝膠電泳后，TT基因型可分離出兩個條帶538bp和388bp，CT基因型可分離出四個條帶538bp、388bp、347bp和191bp，CC基因型可分離出三個條帶388bp、347bp和191bp；

基因組結構分析發現，啟動子P3位于牛HMGB3基因的第三內含子中，與HMGB3轉錄本2相差7個堿基，結合牛HMGB3基因轉錄本2的基因表達結果，表明，啟動子P3負責啟動轉錄本2的轉錄，為了進一步研究該SNP(g.+2690C＞T)對P3啟動子的活性是否有影響，將序列包含C和T等位基因的g.+2253～g.+3035兩個啟動子片段分別構建入pEGFP-N1載體，命名為pEGFP-N1-P3-WT和pEGFP-N1-P3-MT，轉染293T細胞24和48小時后，在熒光顯微鏡下觀察其熒光強度，分析發現含有T等位基因的啟動子片段活性高于含有C等位基因的片段活性，表明T等位基因片段具有更高的啟動子活性，可促進HMGB3基因的轉錄，為進一步分析啟動子P3的g.+2690C＞T突變是否影響轉錄因子結合位點，用軟件分析P3序列突變前后，轉錄因子結合位點，結果發現，C突變為T后，刪除了1個轉錄因子E2F結合位點，導致了HMGB3基因啟動子P3具有更強的啟動子活性；

選擇HMGB3基因序列上P3啟動子鑒別到的SNP位點在302頭中國荷斯坦奶牛個體中，對SNP進行酶切基因分型，采用SAS8.1軟件進行關聯性分析，發現TT基因型個體的SCS顯著低于具有CC和CT基因型個體的SCS，表明HMGB3基因g.2690位點的TT基因型是乳腺炎抗性的有利基因型，可以在奶牛育種改良過程中作為候選基因的功能性分子標記，用于輔助選擇具有更高乳腺炎抗性的個體，通過分子標記輔助選育乳腺炎抗性個體，從而培育出抗乳腺炎的優良種牛新品系。