[發(fā)明專利]細(xì)胞色素P450BM-3(D168L/E435T)變體酶及其編碼基因和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210256860.2
• 申請日: 2012-07-24
• 公開（公告）號: CN102757944A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梅樂和;張澎湃;胡升;胡桂香;雷引林
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種變體酶，尤其涉及一種細(xì)胞色素P450BM-3(D168L/E435T)變體酶及其編碼基因和用途。

背景技術(shù)

靛藍(lán)是一種具有悠久歷史的天然染料，無論是古埃及木乃伊穿著的一些服裝，還是我國馬王堆漢墓出土的藍(lán)色麻織物，它們的顏色都來自靛藍(lán)。靛藍(lán)之所以得到人們長期、廣泛的青睞，最關(guān)鍵的一點在于它具有其它染料無法比擬的染著牢固度和耐光堅牢度，因此，靛藍(lán)也被稱為“染料之王”。

在遠(yuǎn)古時代，靛藍(lán)主要從含有靛藍(lán)的植物(如菘藍(lán)、蓼藍(lán)、木藍(lán)等)中獲得。到了19世紀(jì)中葉，由于天然靛藍(lán)的生產(chǎn)無法滿足紡織工業(yè)迅猛發(fā)展的需求，人們開始嘗試采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)。1897年，德國巴斯夫生產(chǎn)的合成靛藍(lán)問世，并以生產(chǎn)簡便、原料充足、純度高、易貯運、使用方便等優(yōu)點，得以迅速普及，最終使得應(yīng)用了幾千年歷史的植物靛藍(lán)黯然失色，于20世紀(jì)60年代退出了歷史舞臺。20世紀(jì)80年代后，隨著社會文明程度的提高和環(huán)保意識的增強，天然靛藍(lán)重新獲得了人們的關(guān)注和重視。

采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)時，需要使用對呼吸道、中樞神經(jīng)及肝臟均有毒害、可導(dǎo)致人體中毒的苯胺和鄰苯二甲酸酐。這不僅影響了所合成的靛藍(lán)的安全性，而且也對環(huán)境具有污染。由于而今不可能再大量種植與糧食作物爭地的產(chǎn)靛藍(lán)植物，人們把生產(chǎn)天然靛藍(lán)的希望寄托于靛藍(lán)的生物制備技術(shù)，試圖通過那些能催化吲哚轉(zhuǎn)化為靛藍(lán)的生物催化劑實現(xiàn)靛藍(lán)的綠色制備。利用生物催化劑進行靛藍(lán)的生物制備具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、能耗低、產(chǎn)生的有害廢物少、產(chǎn)品安全等優(yōu)點，對保護環(huán)境、維持生態(tài)平衡等具有明顯優(yōu)勢，所以，生物法生產(chǎn)靛藍(lán)取代靛藍(lán)的化學(xué)合成得到了很多研究者的認(rèn)同和重視。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列能催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的生物催化劑，其中最受關(guān)注的是一種細(xì)胞色素P450BM-3酶。在P450酶系中，細(xì)胞色素P450BM-3酶是從巨大芽孢桿菌(B.megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有中長鏈脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在條件下，可以迅速催化鏈長為C12～C18的飽和脂肪酸末位羥基化，將單個氧插入到不活潑的碳?xì)滏I中。

2000年，德國斯圖加特大學(xué)技術(shù)生化研究所R.D.Schmid領(lǐng)導(dǎo)的科研小組，通過定向進化技術(shù)獲得了具有三個突變位點、能夠催化吲哚生成靛藍(lán)的細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶，這使細(xì)胞色素P450?BM-3酶第一次獲得了催化靛藍(lán)產(chǎn)生的能力(“Directed?evolution?of?the?fatty-acid?hydroxylase?P450?BM-3?into?an?indole-hydroxylating?catalyst”Chemistry-A?European?Journal，Li?Q?S，Schwaneberg?U，F(xiàn)ischer?P，Schmid?R?D.2000，6：1531～1536)。但是，該變體酶催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的活力還較低，因此有必要通過進一步的蛋白質(zhì)改造，提高細(xì)胞色素P450BM-3酶對吲哚的親和力和催化活力，提高靛藍(lán)生物制備的效率。

公開號分別為“CN?1900285A”、“CN?1900286A”、“CN?1900287A”的中國專利公開了三種細(xì)胞色素P450BM-3酶的變體基因，該三種變體基因分別將第168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榻M氨酸的密碼子、將168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榱涟彼岬拿艽a子、將435位谷氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子，該三種變體基因編碼的細(xì)胞色素P450BM-3酶與底物親和能力較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，解決了傳統(tǒng)變體酶與底物親和力較小，催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的效率較小的問題。

一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，命名為細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶，本發(fā)明簡寫為細(xì)胞色素P450BM-3(D168L/E435T)變體酶。

本發(fā)明通過定點突變，在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基礎(chǔ)上引入了兩個突變位點，即168位點由天冬氨酸(D)突變?yōu)榱涟彼?L)，435位點由谷氨酸(E)突變?yōu)樘K氨酸(T)。

本發(fā)明還提供了一種編碼所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因，其堿基序列可以如SEQ?ID?NO.2所示。

所述基因通過如下方法獲得：