[發明專利]細胞色素P450BM-3(V445A)變體酶及其編碼基因和用途

無效

• 申請號: 201210256836.9
• 申請日: 2012-07-24
• 公開（公告）號: CN102757943A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 梅樂和;張澎湃;胡升;雷引林;金志華;胡桂香
• 申請（專利權）人: 浙江大學寧波理工學院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及一種變體酶，尤其涉及一種細胞色素P450BM-3(V445A)變體酶及其編碼基因和用途。?

背景技術

靛藍是一種具有悠久歷史的天然染料，無論是古埃及木乃伊穿著的一些服裝，還是我國馬王堆漢墓出土的藍色麻織物，它們的顏色都來自靛藍。靛藍之所以得到人們長期、廣泛的青睞，最關鍵的一點在于它具有其他染料無法比擬的染著牢固度和耐光堅牢度，因此，靛藍也被稱為“染料之王”。?

在遠古時代，靛藍主要從含有靛藍的植物(如菘藍、蓼藍、木藍等)中獲得。到了19世紀中葉，由于天然靛藍的生產無法滿足紡織工業迅猛發展的需求，人們開始嘗試采用化學方法合成靛藍。1897年，德國巴斯夫生產的合成靛藍問世，并以生產簡便、原料充足、純度高、易貯運、使用方便等優點，得以迅速普及，最終使得應用了幾千年歷史的植物靛藍黯然失色，最終于20世紀60年代退出了歷史舞臺。20世紀80年代后，隨著社會文明程度的提高和環保意識的增強，天然靛藍重新獲得了人們的關注和重視。?

采用化學方法合成靛藍時，需要使用對呼吸道、中樞神經及肝臟均有毒害、可導致人體中毒的苯胺和鄰苯二甲酸酐。這不僅影響了所合成的靛藍的安全性，而且也對環境具有污染。由于而今不可能再大量種植與糧食作物爭地的產靛藍植物，人們把生產天然靛藍的希望寄托于靛藍的生物制備技術，試圖通過那些能催化吲哚轉化為靛藍的生物催化劑實現靛藍的綠色制備。利用生物催化劑進行靛藍的生物制備具有生產成本低、生產條件溫和、能耗低、產生的有害廢物少、產品安全等優點，對保護環境、維持生態平衡等具有明顯優勢，所以，生物法生產靛藍取代靛藍的化學合成得到了很多研究者的認同和重視。?

目前，已經發現了一系列能催化吲哚生產靛藍的生物催化劑，其中最受關注的是一種細胞色素P450?BM-3酶。在P450酶系中，細胞色素P450?BM-3酶是從巨大芽孢桿菌(B.megaterium)中發現的具有中長鏈脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在條件下，可以迅速催化鏈長為C12～C18的飽和脂肪酸末位羥基化，將單個氧插入到不活潑的碳氫鍵中。?

2000年，德國斯圖加特大學技術生化研究所R.D.Schmid領導的科研小組，通過定向進化技術獲得了具有三個突變位點、能夠催化吲哚生成靛藍的細胞色?素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶，這使細胞色素P450BM-3酶第一次獲得了催化靛藍產生的能力(Directed?evolution?of?the?fatty-acid?hydroxylase?P450?BM-3?into?an?indole-hydroxylating?catalyst”Chemistry-A?European?Journal，Li?Q?S，Schwaneberg?U，Fischer?P，Schmid?R?D.2000，6：1531～1536)。但是，該突變酶催化吲哚生產靛藍的活力還較低，因此有必要通過進一步的蛋白質改造，提高細胞色素P450BM-3酶對吲哚的親和力和催化活力，提高靛藍生物制備的效率。?

公開號分別為“CN?1900285A”、“CN?1900286A”、“CN?1900287A”的中國專利公開了三種細胞色素P450BM-3酶的變體基因，該三種變體基因分別將第168位天冬氨酸的密碼子突變為組氨酸的密碼子、將168位天冬氨酸的密碼子突變為亮氨酸的密碼子、將435位谷氨酸的密碼子突變為蘇氨酸的密碼子，該三種變體基因編碼的細胞色素P450BM-3酶與底物親和能力較低。?

發明內容

本發明提供了一種細胞色素P450BM-3(V445A)變體酶，解決了傳統變體酶與底物親和力較小，熱穩定性差，催化吲哚生成靛藍的效率較低的問題。?

一種細胞色素P450BM-3變體酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，命名為細胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/V445A)變體酶，簡稱為細胞色素P450?BM-3(V445A)變體酶。?

本發明通過定點突變，在細胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基礎上引入了一個突變位點，即445位點由纈氨酸(V)突變為丙氨酸(A)。該突變位置序號為蛋白不包括起始密碼子編碼氨基酸的順序號。?

本發明還提供了一種編碼所述細胞色素P450BM-3變體酶的基因，其堿基序列可以如SEQ?ID?NO.2所示。?

該基因在通過如下方法獲得：?