[發(fā)明專利]一種含有乳蛋白和脂肪酸的組合物及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210256596.2
• 申請(qǐng)日: 2012-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN103372202A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方冰;王鵬杰;張明;郭慧媛;張昊;任發(fā)政
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 任發(fā)政
• 主分類號(hào): A61K38/40
• 分類號(hào): A61K38/40;A61P35/00;A61K31/201
• 代理公司: 北京潤平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 王崇;王鳳桐

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種含有乳蛋白和脂肪酸的組合物及其制備方法與應(yīng)用，更具體地，涉及一種含有乳蛋白和脂肪酸的組合物制備方法、由該方法制得的含有乳蛋白和脂肪酸的組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

人乳中含有一種可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的復(fù)合物-HAMLET（Human?Alpha-lactalbumin?Made?Lethal?to?Tumor?Cells），該復(fù)合物由部分折疊的乳白蛋白和油酸組成。乳白蛋白本身并沒有促使腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，必須同油酸結(jié)合后才能具備抗腫瘤活性。通過NMR、透射電鏡及原子力顯微鏡觀察HAMLET結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，油酸不是單純地與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈結(jié)合，而是被蛋白質(zhì)包裹而形成膠囊狀復(fù)合物。乳白蛋白的折疊核心位點(diǎn)在包含Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn)的α-區(qū)域和β-區(qū)域的界面上，由此可以推測(cè)，油酸的結(jié)合區(qū)域很有可能是在Ca²⁺結(jié)合區(qū)域。油酸的結(jié)合使得乳白蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變并在一定程度上穩(wěn)定了HAMLET的構(gòu)象。通過研究不同碳鏈長度、不同飽和度、不同雙鍵構(gòu)型的脂肪酸同乳白蛋白結(jié)合形成HAMLET的能力發(fā)現(xiàn)，乳白蛋白只能同油酸形成具有抗腫瘤活性的復(fù)合物，而與其他十八碳飽和（如硬脂酸）、不飽和（如亞油酸）脂肪酸形成的復(fù)合物基本無抗腫瘤活性，其他較短碳鏈的飽和及不飽和脂肪酸、反式脂肪酸（包括十八碳）均不能同乳白蛋白結(jié)合，表明脂肪酸同部分伸展的乳白蛋白形成了特定的構(gòu)型，從而使得這些復(fù)合物能夠特異性殺死腫瘤細(xì)胞。

HAMLET能特異性的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞膜通透性；作用于線粒體使其膨大并釋放促凋亡的細(xì)胞色素c等相關(guān)蛋白；結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的20S蛋白酶體，改變其結(jié)構(gòu)，從而激活細(xì)胞內(nèi)蛋白酶而降解大量的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，即使隨后去除進(jìn)入細(xì)胞的HAMLET，蛋白酶仍能降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。研究表明，以半數(shù)致死量的HAMLET培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞1小時(shí)，90%的HAMLET定位于細(xì)胞核內(nèi)并以高親和力結(jié)合組蛋白，破壞組蛋白在DNA上的沉積，最終以高親和力結(jié)合染色質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)形成非水溶性復(fù)合物，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄停止，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

迄今為止，已測(cè)定了HAMLET對(duì)來源于肺、喉、腎、結(jié)腸、膀胱、前列腺、卵巢、皮膚、淋巴等40余種腫瘤細(xì)胞的作用。所有檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞在HAMLET處理后均發(fā)生了凋亡，尤其是淋巴類腫瘤細(xì)胞，對(duì)HAMLET的敏感性要高于其他實(shí)體瘤細(xì)胞。在體內(nèi)，在人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及膀胱癌的模型鼠中灌注HAMLET，不僅可以顯著減小腫瘤體積，還能延長老鼠的生存期。在臨床研究中，HAMLET也在皮膚乳頭狀瘤及膀胱癌上取得了顯著的治療效果。尤其是皮膚乳頭狀瘤的治療中，對(duì)所有接受過HAMLET治療的患者進(jìn)行為期兩年的觀察發(fā)現(xiàn)，這些患者的腫瘤并未復(fù)發(fā)，且未出現(xiàn)其他副作用。同時(shí)，HAMLET僅分布于腫瘤組織中，在腫瘤組織周圍的正常組織中并無分布。

除了直接從人乳中提取外，目前制備HAMLET的方法有兩類，利用天然的人或牛α-乳白蛋白轉(zhuǎn)化得到。一類是傳統(tǒng)的制備方法，包括先將油酸溶于乙醇中，再用緩沖液稀釋，與陰離子交換層析基質(zhì)充分作用，通過鹽離子梯度洗脫是油酸均勻結(jié)合到基質(zhì)上，再加入已脫除Ca²⁺的α-乳白蛋白溶液，利用高鹽溶液的梯度洗脫，在高鹽濃度時(shí)洗脫下來的組分即為活性物質(zhì)HAMLET。這種方法操作復(fù)雜，成本較高，而且只能制備α-乳白蛋白和油酸的復(fù)合物，其他的脂肪酸（如亞油酸）大多無法與α-乳白蛋白結(jié)合，即使結(jié)合了，形成的復(fù)合物也基本無抗腫瘤活性。

另一類方法主要是利用溫度或者pH使得α-乳白蛋白的結(jié)構(gòu)部分折疊，與油酸混合后制備得到，這種方法又包括在pH4.0-4.3室溫條件下制備，在中性條件下45-60℃加熱制備，在pH12的條件下制備三種方法。這種方法獲得的α-乳白蛋白-油酸復(fù)合物的抗腫瘤活性較低，而且目前的研究也僅限于乳白蛋白-油酸復(fù)合物，其他乳蛋白與其他長鏈不飽和脂肪酸的復(fù)合物的抗腫瘤活性尚待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗腫瘤活性較高的乳蛋白-不飽和脂肪酸組合物的制備方法以及由該方法制得的含有乳蛋白和脂肪酸的組合物及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種含有乳蛋白和脂肪酸的組合物的制備方法，其特征在于，該方法包括：

（1）將乳蛋白溶于蛋白緩沖液中，得到乳蛋白溶液，其中，所述乳蛋白溶液的pH值為5-9，優(yōu)選為7-9；

（2）向得到的乳蛋白溶液中加入不飽和脂肪酸并混合均勻，得到混合均勻的物料；