[發明專利]一種基于雙酶偶聯高通量檢測微生物生產二元酸的新方法

無效

• 申請號: 201210255817.4
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN103571915A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 王欽宏;孫琳;涂然;齊顯尼;姜丹;馬延和
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/28
• 分類號: C12Q1/28;C12Q1/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于工業微生物篩選和開發利用領域，特別涉及一種基于雙酶偶聯反應的高通量檢查微生物生產二元酸的檢測方法。

技術背景

從自然界篩選并在實驗室誘變進化一直是發現和創新工業微生物菌種的重要途徑，是工業生物技術產業的基礎。代謝工程極大的促進了應用于工業的各種化合物的工程菌株的改進。特別是近數十年來，代謝工程邁向了新的階段——系統代謝工程。系統代謝工程與具有全局理念的系統生物學、具有精細設計能力的合成生物學以及理性-隨機突變的進化工程有機整合一起，使得代謝工程有了更廣泛的應用，能夠更加省時省力地生產天然的以及非天然的化學品、燃料和聚合物。例如，關鍵酶通過系統與合成生物學的方法協同改造或者構建，然后通過系統生物學的研究方法找出提高產量的瓶頸或者抑制細胞生長的未知因素來改變全局代謝網絡；通過進化工程獲得的菌株可以利用系統生物學的方法闡明突變進化位點，等等。盡管隨著代謝工程和合成生物學的發展，各種生物基化學品生產菌的構建和合成變得相對比較容易，但是由于生物體的復雜性和人類認識的局限性，設計合成得到的工程菌經常不能完全達到高效生產的要求，仍然需要通過誘變或進化的方法實施進一步優化，彌補設計和合成的不足。要實現生物基化學品生產菌的高效誘變和進化改造、優化通常離不開高通量篩選方法。只有高通量篩選方法的建立，并結合先進的現代自動化技術和儀器設備才能大大突破人工篩選在速度、效率和標準化等方面的限制，這將是微生物菌種篩選和改造的一次技術革命。一個方便快捷的篩選檢測方法不但可以簡化篩選步驟，減少科研人員的工作量，而且可以大大促進代謝工程的發展。

二元酸在工業和能源方面有著重要應用，在能源日益枯竭的今天，利用生物質來產生這些工業原料以及能源有著舉足輕重的意義。用微生物細胞工廠生產二元酸，原料來自可再生的生物質資源，而不必消耗石油等不可再生資源，生產過程完全采用生物過程，不使用有毒有害的化學試劑，也不產生任何環境污染物。一旦經濟上可行的生物合成生產工藝被推廣使用，可以促進經濟的發展和解決困擾制約國家國民經濟發展的生態環境問題，保持國家安全、穩定和可持續發展，創造重大的社會經濟效益。

但是傳統定性或定量檢測二元酸的方法非常有限，以丁二酸為例，主要的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、反相高效液相色譜法以及試劑盒檢測。液相色譜法操作比較繁瑣，靈敏度較低，如果檢測樣品較多，也會存在保留時間的偏移等問題。使用試劑盒檢測丁二酸不但價格昂貴，而且對樣品的純度要求嚴格，會受其他物質的干擾。試劑盒檢測需要依賴于NADH，但是NADH相當昂貴，且需要在340nm出測定吸光值，因此就需要紫外檢測器，增加了檢測的費用。因此，研究建立簡便、快速、準確和應用廣泛的二元酸分析方法倍受重視，不僅可以促進生物法生產二元酸的理論研究及產業化，同時對于其他生物產品，如支鏈醇、氨基酸的檢測和工程菌株篩選等也有很好的借鑒作用。

發明內容

【本發明的目的】

本發明的目的在于提供一種基于雙酶偶聯反應的高通量檢測微生物生產以丁二酸為代表的二元酸的新方法。通過二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯的方法測定二元酸，高通量篩選目標微生物。與傳統微生物篩選方法相比，基于雙酶偶聯反應的高通量篩選方法具有成本低、效率高、目的性強的優點，而使用熒光信號檢測大大增加了檢測的靈敏度，能夠從廣泛的自然界中篩選性能優良的菌株。

【本發明的思路】

利用二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯的方法，測定二元酸含量。該方法包含兩個方面內容。一方面，在氧氣存在條件下，二元酸被其氧化酶氧化，生成過氧化氫，形成的過氧化氫與4-安替比林和苯酚在過氧化氫酶作用下形成一種紅色物質醌亞胺。醌亞胺是一種紅色物質，在500nm處有特征吸收值。另一方面，二元酸被其氧化酶作用形成的過氧化氫與AmplexUltraRed在過氧化物酶作用下形成Resorufin。Resorufin是一種熒光底物，在給定了激發光波長后，檢測Ex/Em490/585(nm)處的熒光值，即可反映出待檢測二元酸的量。基于雙酶偶聯的熒光法與化學顯色法相比具有更高的靈敏度和精確度，本專利著重講述前者。微生物代謝產生的二元酸通過96孔黑色微孔板和酶標儀，利用雙酶偶聯方法分析檢測代謝產物，篩選高產各種二元酸的菌株，為基礎和應用研究提供寶貴的菌種資源。

【本發明的技術路線】

本發明的技術路線如下：

(1)利用培養基將待篩選樣品進行活化培養12-24小時；

(2)將富集培養的混合菌利用無菌水進行稀釋(獲得單菌落)，涂布到固體培養基，培養6-12小時；