[發(fā)明專利]一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210255735.X
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102757919A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王李寶;萬夕和;沈輝;凌云;黎慧;鐘非;許程林;陳玉生
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

1.一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，包括：

（1）配制分離異養(yǎng)硝化細(xì)菌用培養(yǎng)基，于121℃下滅菌15-20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至45～50℃后傾倒至滅菌的培養(yǎng)皿中，靜置冷凝成平板；將海水養(yǎng)殖環(huán)境中水樣或者沉積物樣品與無菌海水混合得到稀釋液或均勻懸濁液；將稀釋液或均勻懸濁液再與無菌海水按體積比1:9進(jìn)行梯度稀釋，稀釋6-7次，得到不同濃度的稀釋液；將每一濃度的稀釋樣品在上述平板上攤開，干燥，靜置冷凝后，30℃下培養(yǎng)3-4天；在形成菌落的平板上，挑取單個(gè)菌落按照上述方法再重復(fù)2-3次，即可得到經(jīng)分離純化后的異養(yǎng)菌株；

（2）在步驟（1）中得到的平板上以點(diǎn)接種方式接種上述異養(yǎng)菌株，30℃下培養(yǎng)3-4天后，形成單菌落后，用格利斯試劑點(diǎn)滴于菌落上，挑取菌落周邊紅色深的，作為硝化能力復(fù)核用的供試菌株；

（3）將由步驟（2）篩選出的供試菌株用接種環(huán)挑取一菌環(huán)菌苔接種于含唯一碳源的復(fù)核用培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)期間每隔3天取培養(yǎng)液至潔凈試管，將格利斯試劑點(diǎn)滴入試管中進(jìn)行硝化活性確認(rèn)，并以不接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照，同樣選擇紅色深的菌株作為脫硫細(xì)菌篩選用的供試菌株；

（4）將由步驟（3）篩選出的供試菌株用接種環(huán)挑取一菌環(huán)菌苔接種于脫硫細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)，并同時(shí)做不接菌株的空白對照；用碘量法測定培養(yǎng)液中硫化物含量，選擇硫化物含量明顯降低的菌株作為同步去除銨態(tài)氮和硫化物能力測試用的供試菌株；

（5）將由步驟（4）篩選出的供試菌株同樣在脫硫細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中取樣，用鈉氏試劑比色法測定培養(yǎng)液中銨態(tài)氮濃度，并用碘量法測定培養(yǎng)液中硫化物含量，驗(yàn)證供試菌株的同步去除銨態(tài)氮和硫化物能力；選擇去除銨態(tài)氮和硫化物效果好的，即得所需異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（1）中的分離異養(yǎng)硝化細(xì)菌用培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨5g，酵母膏1g，瓊脂粉18g，海水1L，pH?8.2-8.4。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（1）中的水樣與無菌海水按體積比1:9混合；沉積物樣品與無菌海水按質(zhì)量體積比1g:99mL混合。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（1）中的形成菌落的平板具體為每個(gè)平板有90-100個(gè)菌落。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（2）中的單菌落的直徑為1.8~2.2mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（2）中的格利斯試劑的配制方法為：將對氨基苯璜酸0.5g溶于30mL冰醋酸和100mL蒸餾水的混合液中，過濾后制得對氨基苯磺酸溶液；稱取0.1gα-萘胺溶解于100mL熱蒸餾水中，冷卻后，加入30mL冰醋酸，過濾后制得α-萘胺溶液；將兩種溶液等量混合，即得格利斯試劑。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（3）中的含唯一碳源的復(fù)核用培養(yǎng)基的組成為：(NH₄)₂SO₄?2.0g，MgSO₄·7H₂O0.03g，F(xiàn)eSO₄?0.01g，NaH₂PO₄?0.25g，K₂HPO₄?0.75g，MnSO₄·4H₂O?0.01g，海水1L，pH值7.0～7.2；碳源為0.01mol/L的乙酸鈉。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述步驟（4）中的脫硫細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基的組成為：（NH₄）₂SO₄?0.5g，蔗糖5.0g，牛肉膏1.0g，Na₂S飽和液1.5mL，1L海水，pH7.6～7.8。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種海水養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)硝化脫硫細(xì)菌的篩選方法，其特征在于：所述脫硫細(xì)菌篩選用培養(yǎng)基于121℃下滅菌15-20分鐘。