[發明專利]三種細菌的PCR檢測引物及其應用

無效

• 申請號: 201210255333.X
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102747162A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 劉磊;張亮;郭玉蓉
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

技術領域

本發明涉及PCR引物，具體地，涉及三種細菌的PCR檢測引物。

背景技術

多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增。可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染，可系統組合的有:?①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者體內，有時存在多種肝炎病毒重疊感染，有時是甲乙丙型肝炎病毒重疊;有時可能是甲乙型肝炎病毒重疊;有時是乙丙型肝炎病毒重疊。②腸道致病性細菌的檢測，如傷寒，痢疾和霍亂，有時具有較相同的腸道癥狀，有時痢疾霍亂同存一病人并同時發病。③性病的檢測，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷。④戰傷細菌及生物戰劑細菌的檢測，如破傷風桿菌，產氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢。⑤需特殊培養的無芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等。

多重PCR的特點有:?①高效性，在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。②系統性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時偵檢。③經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。

在多重PCR反應體系中，引物之間的相互作用嚴重影響著多重PCR的結果，故在多重PCR建立之初需要明確引物之間存在怎樣的相互影響。除引物之間的相互影響外，引物的濃度對多重PCR的穩定性和靈敏度也有重要影響。

目前國內還未出現針對脂環酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌的多重PCR檢測引物及檢測方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一種針對脂環酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌同時進行檢測的多重PCR檢測引物，本發明建立的多重PCR檢測方法的最大優勢就是實現了“一管三檢”，不僅提高了檢測效率，還降低了檢測過程中因操作導致的誤差。

本發明提供了如下的技術方案：

三種細菌的PCR檢測引物，其中，三種細菌為脂環酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌，包括以下3對引物：

脂環酸芽孢桿菌的檢測引物：

上游引物SEQ?ID?NO.1：5'-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3'

下游引物SEQ?ID?NO.2：5'-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3'

大腸埃希氏菌的檢測引物：

上游引物SEQ?ID?NO.3：5'-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3'

下游引物SEQ?ID?NO.4：5'-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3'

沙門氏菌的檢測引物：

上游引物SEQ?ID?NO.5：5'-TACTTAACAGTGCTCGTTTAC-3'

下游引物SEQ?ID?NO.6：5'-ATAAACTTCATCGCACCGTCA-3'

三種細菌的PCR檢測引物在脂環酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌PCR檢測中的應用。

本發明具有以下有益效果：

本研究嘗試用多重PCR檢測脂環酸芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌。由于沒有果汁中細菌多重PCR檢測方法的相關報道，故與常規方法比較后發現，本研究建立的三重PCR檢測方法有相同的靈敏度，并能實現一個反應檢測3種污染菌，大大提高了檢測效率。在人工模擬試驗中，建立的三重PCR檢測方法能夠在小于100個菌體每毫升的染菌量下擴增出特異性條帶，說明該檢測方法符合實際檢測要求。另外，當前用于果汁污染菌檢測的PCR技術由于受到不能區分病原菌的死活而在實際應用中受到限制，而本試驗對樣品先進行預增菌，再取增菌液進行檢測，檢測的是活的菌體。這雖然較直接從樣品中提取基因組進行檢測多耗費時間，但增菌過程在大大的提高了多重PCR檢測敏感性的同時，還避免了果汁中其他成分對DNA提取的影響以及DNA污染所帶來的假陽性結果。