[發明專利]一種CD14真核表達載體的構建及其高表達細胞株的制備

無效

• 申請號: 201210254929.8
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102757958A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 李康;旦增
• 申請（專利權）人: 西藏自治區人民醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/79;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/68;C07K14/705;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種CD14基因的特異性引物對，其序列為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2。

2.CD14真核表達載體制備方法，其通過如下步驟制備，表達CD14的細胞總RNA的提取、CD14編碼區的克隆、真核表達載體的構建。

3.根據權利要求2所述的CD14真核表達載體制備方法，其特征在于，所述的表達CD14的細胞總RNA的提取、CD14編碼區的克隆、真核表達載體的構建，

具體方法如下：

1)表達CD14的細胞總RNA的提取

a)收集所培養的SGC-7901細胞加入1ml?Trizol裂解液，室溫下靜置5min。

b)加入200μl三氯甲烷，充分混勻，室溫放置3min，12000rpm離心10min，取上清。

c)加入500μl異丙醇混勻，室溫靜置10min，12,000rpm離心10min。

d)棄上清，加1ml75％的乙醇漂洗，7500rpm離心5min。

e)吸取75％的乙醇，于超凈臺晾干，直到EP管底部的RNA變透明，加入20μl?RNase-free?ddH₂O，所得即為細胞總RNA。

2)CD14編碼區的克隆

a)利用TIANScript?cDNA第一鏈合成試劑盒，將上一步得到的總RNA進行反轉錄反應，在200μl反應管中加入總RNA1μg，oligo(dT)1μl，random1μl，dNTP(2.5mM?each)2μl，加ddH₂O至14.5μl，混勻后70℃加熱5min，冰上冷卻2min。瞬時離心后再加入5×First-Strand?Buffer?4μl，RNasin0.5μl，TIANScript?M-MLV1μl(200U)，總反應體積為20μl，混勻后42℃溫浴50min，95℃加熱5min終止反應。

b)取1μl反轉錄產物，加入上述權利要求1所述的引物對各1μl，2×TaqPCR?Master?Mix10μl，用ddH₂O補足20μl。PCR反應程序為：95℃5min；95℃20s，60℃20s，72℃30s，30個循環；72℃5min結束反應。將產物進行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化，得到CD14編碼區DNA。

3)CD14真核表達載體的構建

用HindIII和BamHI雙酶切pcDNA3.1-EGFP質粒DNA及純化的CD14編碼區DNA，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化目的片段，加入T4DNAligase，16℃連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。挑取單克隆置于培養基中振蕩培養，提取質粒進行酶切鑒定，并將切下目的條帶的質粒送測序公司進行測序。

4.一種穩定轉染細胞株的方法，包括將權利要求2-3任意一項所述的CD14真核表達載體轉染、穩轉細胞系的篩選、穩轉細胞系中CD14的表達鑒定。