[發明專利]玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法

有效

• 申請號: 201210252464.2
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102747135A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 郭新梅;宋希云;葉克蓯;裴玉賀;張恩盈
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/527
• 分類號: C12Q1/527;C12Q1/28;C12Q1/26
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 胡長遠

1.玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法，按照如下方法進行：

(1)將3葉期的玉米自交系幼苗自根莖處剪下，放入濃度為20～100μg/mL玉米新月彎孢菌毒素溶液中，利用真空泵產生的200mmHg負壓力進行滲透6～48h，然后于25℃恒溫箱中靜置18h；

(2)取步驟(1)中經過玉米新月彎孢菌毒素處理過的玉米自交系幼苗的第3片葉，剪去葉尖，取葉片中上部，用濾紙吸干水，稱取葉片1.0g和石英砂0.1g，放入研缽中，加入pH8.8、0.05mol/L的硼酸鈉緩沖液2.0ml，研磨成勻漿，將勻漿轉入離心管中，并用硼酸鈉緩沖液2.0mL沖洗研缽上的殘留部分，轉入離心管，攪動5min；然后在4℃、12000g下離心30min，取上清液；將3ml上清液用pH8.8、0.05mol/L硼酸鈉緩沖液稀釋成15ml，得稀釋的上清液，-4℃下保存；其中所述的硼酸鈉緩沖液中含有5mmol/L巰基乙醇和1mmol/LEDTA；所述的上清液為苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的混合粗提液；

(3)分別測定步驟(2)中所得的稀釋的上清液中苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性；并計算出每種酶的比活力，比活力計算公式為：比活力＝酶活性/蛋白含量，再按照下述公式分別計算玉米自交系抗病性的抗性等級數值x₁、x₂和x₃，

y₁＝22.13x₁+35.17???????????????(公式1)；

y₂＝50.17x₂²-136.9x₂+222.5??????(公式2)；

y₃＝-4.432x₃+38.04??????????????(公式3)；

其中y₁為苯丙氨酸解氨酶(PAL)的比活力；y₂為過氧化物酶(POD)的比活力；其中y₃為超氧化物歧化酶(SOD)的比活力；

(4)計算x₁、x₂和x₃的平均值x，即x＝(x₁+x₂+x₃)/3，選取x≥3的玉米自交系，即為抗玉米彎孢菌葉斑病的自交系。

2.按照權利要求1所述的早期鑒定方法，其特征在于其步驟(1)中所述的玉米新月彎孢菌毒素溶液，按照如下方法制備：將玉米新月彎孢菌菌株培養在PDA培養基上，培養7d后用打孔器在培養的菌落上打孔，將6個新月彎孢菌菌片接于100mL改良Fries液體培養基中，于25℃、120rpm下培養振蕩培養10～15d；用活性炭柱過濾上述液體培養基，流速為4.2mL/min，用300mL甲醇洗脫炭柱3次，每次100mL；每次甲醇洗脫后再用100mL蒸餾水洗滌，混合3次甲醇洗脫液，于60～70℃水浴鍋中濃縮至大約10mL；在25～65℃恒溫箱中蒸干，獲得漿狀物；將所得漿狀物溶于50mL溫度在25～37℃的甲醇中；過濾，除去不溶物，取濾液，加3倍體積的氯仿混合，在25℃下靜置過夜，蒸干甲醇、氯仿溶解層，獲得黃褐色晶體，即為新月彎孢菌粗毒素；加蒸餾水溶解，制成濃度為20～100μg/mL新月彎孢菌毒素溶液；其中所述的PDA培養基的組成成分及其重量比為：每1L蒸餾水中含馬鈴薯200g和葡萄糖15g；所述的改良Fries液體培養基組成成分及其比例為：每1L蒸餾水中含蔗糖20g、酒石酸氨5g、NH₄NO₃?1g、KH₂PO₄?1g、氯化鈉0.1g、七水硫酸鎂0.5g、氯化鈣0.13g和酵母膏1g，pH6.2。

3.按照權利要求1所述的早期鑒定方法，其特征在于其步驟(3)中所述的苯丙氨酸解氨酶活性的測定，取其步驟(2)中所得的稀釋的上清液1ml，然后以L-苯丙氨酸為底物，在290nm處測定苯丙氨酸解氨酶的酶活；以每小時使OD₂₉₀增加0.01的酶量定為一個酶活單位，計算苯丙氨酸解氨酶的比活力。