[發明專利]一種生產木糖異構酶的方法

無效

• 申請號: 201210251839.3
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102747063A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 張愛聯;尹慧祥;易國輝
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/81;C12N15/75;C12R1/465;C12R1/19;C12R1/01;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/125
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及構建微生物工程菌生產重組酶。具體是應用微生物工程菌生產重組木糖異構酶。

背景技術

木糖異構酶(Xylose?Isomerase?EC5.3.1.5)是具有變構作用的酶。木糖異構酶的主要作用是催化D-木糖(醛戊糖)與D-木酮糖(酮戊糖)相互轉換的酶，也作用于D-萄萄糖得到D-果糖。木糖異構酶主要應用于果葡糖漿工業、生產半纖維素乙醇工業、作為食品添加劑和飼料添加劑等。不同的用途對于木糖異構酶作用的適合溫度和pH有著不同的要求。當前市場上的異淀粉酶產品是來源于天然菌株生產的木糖異構酶，由于天然菌株中的木糖異構酶基因是由單種木糖異構酶基因編碼，其適合反應溫度范圍和適合反應pH范圍窄。所以，當前的木糖異構酶產品不能滿足和適合于當前市場的需求。

畢赤酵母(Pichia?pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)和枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)都是常用于生產重組蛋白的宿主菌，但各具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達產物的純化的特點，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于固態厭氧發酵生產重組酶。

發明內容

當前市面上只有這些酶的單種酶，尚沒有混合表達這些酶的菌種和混合酶產品。來源于棲熱菌(Thermus)的木糖異構酶最適pH?7，最適合溫度90℃，在80至95℃和pH6.2至7的條件下有80％的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性；來源于鏈霉菌(Streptomyces)的木糖異構酶最適pH?8，最適合溫度80℃，在68至86℃和pH6.8至8.5的條件下有80％的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性；來源于大腸桿菌(Escherichia?coli)的木糖異構酶最適pH?6，最適合溫度50℃，在37至60℃和pH4.8至7.2的條件下有80％的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性。從上述可見，若將上述這三種不同來源的木糖異構酶制備成混合酶產品，那么這種混合酶的的適合反應溫度和pH范圍將明顯較其中的單種酶廣。

本發明應用分子生物學技術構建含棲熱菌的木糖異構酶基因表達框架、鏈霉菌的木糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的木糖異構酶基因表達框架(說明.表達框架：啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子)的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌。用含三種木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產重組混合木糖異構酶。

本發明所采用的技術方案是：

1.克隆酶基因：應用分子生物學技術，從棲熱菌(Thermus)基因組中擴增木糖異構酶基因，從鏈霉菌(Streptomyces)基因組中擴增木糖異構酶基因，從大腸桿菌(Escherichia?coli)基因組中克隆木糖異構酶基因。

2.獲得構建表達載體所需的啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止子序列和抗性基因。

3.構建如附圖1的畢赤酵母表達載體、附圖2的釀酒酵母表達載體和附圖3的枯草芽孢桿菌表達載體。

4.應用電轉化方法將含三種木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母基因組；應用電轉化方法將含三種木糖異構酶基因表達框架的釀酒酵母表達載體轉化釀酒酵母基因組；應用電轉化方法將含三種木糖異構酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體轉化枯草芽孢桿菌基因組。用PCR和DNA序列測定方法驗證重組子。分別篩選高表達木糖異構酶的畢赤酵母重組子、釀酒酵母重組子和枯草芽孢桿菌重組子作為含三種木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌。

5.發酵含三種木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產重組混合木糖異構酶。

本發明構建含三種木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產重組混合木糖異構酶的優點體現于：

(1)為市場提供適合反應溫度范圍廣和適合反應pH范圍廣的木糖異構酶產品。

(2)取代分別發酵含棲熱菌的木糖異構酶基因表達框架的菌株生產木糖異構酶，發酵含鏈霉菌的木糖異構酶基因表達框架菌株生產木糖異構酶，發酵含大腸桿菌的木糖異構酶基因表達框架的菌株生產木糖異構酶。即不僅提高了產品的性能并且實現用一個發酵工序生產三種木糖異構酶取代用多個工序分別生產三種木糖異構酶，達到節省了原材料、能耗和人力資源的作用。