[發(fā)明專(zhuān)利]可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白及其重組載體與應(yīng)用無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210250346.8 | 申請(qǐng)日： | 2012-07-18 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN102807622A | 公開(kāi)（公告）日： | 2012-12-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 秦俊文;謝琪璇;蔡冬青;秋山泰身;井上純一郎;禹艷紅;齊緒峰;武征 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 暨南大學(xué) |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C07K19/00 | 分類(lèi)號(hào)： | C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/867;C12N15/66 |
| 代理公司： | 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245 | 代理人： | 裘暉;陳燕嫻 |
| 地址： | 510632 廣*** | 國(guó)省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 靶向 激活 traf6 信號(hào) 通路 融合 蛋白 及其 重組 載體 應(yīng)用 | ||
1.一種可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白，其特征在于：編碼所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.一種重組載體，其特征在于：含有編碼如權(quán)利要求1所述的可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體為將SEQID?NO.2所示的基因克隆至慢病毒載體得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述的慢病毒載體為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH重組質(zhì)粒，其通過(guò)如下方法制備得到：
（1）以結(jié)核桿菌DNA為模板，以FP和RP為引物，PCR反應(yīng)獲得Gyrase?B基因；
FP：ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC；
RP：ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA?GCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC；
（2）通過(guò)EcoR?I酶和Spe?I酶分別雙酶切pENTR-2B載體和步驟（1）得到的Gyrase?B基因，酶切后純化，得到雙酶切的pENTR-2B載體和雙酶切的GyraseB基因；再將雙酶切的pENTR-2B載體和雙酶切的Gyrase?B基因連接，得到重組載體pENTR-2B-Gyrase?B-HA；用EcoR?I酶單酶切重組載體pENTR-2B-GyraseB-HA，去磷酸化，得到單酶切后的pENTR-2B-Gyrase?B-HA；
（3）以小鼠脾臟cDNA為模板，F(xiàn)P2和RP2為引物，PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段；用EcoRI酶單酶切包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段，得到單酶切后的包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段；
FP2：ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAG
RP2：ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC；
（4）將步驟（2）得到的單酶切后的pENTR-2B-Gyrase?B-HA和步驟（3）得到的單酶切后的包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段連接，得到重組載體pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH；
（5）通過(guò)Gateway技術(shù)將位于重組載體pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH上的T6RZ-GH雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至慢病毒載體CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到重組質(zhì)粒CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：
步驟（1）和（2）中所述的PCR反應(yīng)的條件為：94℃2min；94℃15sec、55℃15sec、68℃30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：
步驟（5）所述的Gateway技術(shù)的反應(yīng)體系為：
其中，TE的組成為10mM?Tris-HCl、1mMEDTA，pH值為8；
反應(yīng)條件為：25℃下反應(yīng)6小時(shí)，加1μl濃度為2μg/μl的蛋白酶K，37℃反應(yīng)10分鐘。
9.權(quán)利要求3～8任一項(xiàng)所述的重組載體在TRAF6功能研究中的應(yīng)用。
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