[發(fā)明專利]一種檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210250210.7
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN102719555A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓勇
• 申請（專利權(quán)）人: 韓勇
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒。

背景技術(shù)

CYP3A4基因的全稱叫做細(xì)胞色素P450同工酶3A4，細(xì)胞色素P450（Cytochrome??P450，CYP450）是一組含有亞鐵血紅素蛋白酶系，又稱混合功能單加氧酶系統(tǒng)。它主要存在于人類肝臟，對外源物處置以及內(nèi)源物代謝起重要作用。已發(fā)現(xiàn)與藥物代謝密切相關(guān)的CYP450主要有CYP1～4，其中以CYP3A4亞族最為重要，占人肝臟CYP450總量的30%，主要成員包括CYP3A3、3A4、3A5和3A7，成人肝臟中以3A4為主。

CYP3A4參與的藥物代謝的種類很多，臨床上50%以上的藥物代謝都是通過CYP3A4，主要有：多西他賽（docetaxel）、紫杉醇（paclitaxel）、依托泊苷（etoposide）、伊立替康（irino-tecan）、伊馬替尼（imatinib）、長春瑞賓（vinorelbine）、長春堿（vinblastine）、長春新堿（vincristine）等等。編碼CYP3A4蛋白的CYP3A4基因位于染色體7q21.3～22.1，它包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子的編碼區(qū)域，長約27kb。自1998年以來，國外學(xué)者陸續(xù)報(bào)道CYP3A4基因存在多態(tài)性，根據(jù)近幾年中國的研究文獻(xiàn)報(bào)道，在中國人群中被普遍關(guān)注的是CYP3A4*4基因，在這個(gè)基因中存在一個(gè)有意義的SNP位點(diǎn)（A13871G，I118V），這個(gè)點(diǎn)突變主要是一個(gè)單堿基突變，突變導(dǎo)致118為氨基酸從異亮氨酸變?yōu)轭R氨酸。這個(gè)改變使得代謝酶的活性降低，減弱了個(gè)體對依托泊苷/替尼泊苷藥物代謝能力，增強(qiáng)其毒副作用。根據(jù)衛(wèi)生部最新的《醫(yī)療檢測項(xiàng)目服務(wù)管理規(guī)范》中，在個(gè)體化醫(yī)療項(xiàng)目中，就明確提到了檢測CYP3A4的意義。

目前醫(yī)院用于CYP3A4*4基因分型檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是PCR-直接測序法,?但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細(xì)胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對于含<10%突變細(xì)胞的腫瘤組織以及外周血，常規(guī)PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。

焦磷酸測序（Pyrosequencing）是一種基于聚合原理的DNA測序（確定DNA中核苷酸的順序）方法，是新一代DNA序列分析技術(shù)。它是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP,若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi）。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。通過分析岀峰情況，達(dá)到測定DNA序列的目的。

目前市場上還沒有利用焦磷酸技術(shù)進(jìn)行CYP3A4*4的基因多態(tài)性檢測的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性高、成本低、定量、準(zhǔn)確檢測CYP3A4*4的基因分型的試劑盒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：?

所述檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒中包括如下引物：

正向擴(kuò)增引物：5’-GTCCAGTGGGATTTATGAAAAGTG-3’（SEQ?ID?NO.1）；

反向擴(kuò)增引物：5’-TTCCATTCTTCATCCTCAGCTATA-3’（SEQ?ID?NO.2）；

測序引物：5’-TTCATCCTCAGCTATAGAGA-3’（SEQ?ID?NO.3）；

其中，正向擴(kuò)增引物或反向擴(kuò)增引物中的任意一條引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。

????進(jìn)一步地，所述試劑盒中還包括質(zhì)控品TAYGGTTTGCA（SEQ?ID?NO.4）（control?oligo）和作為空白對照品的超純水；質(zhì)控序列是由QIAGEN設(shè)計(jì)合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark?Q24?測序儀的各項(xiàng)性能指標(biāo)。

進(jìn)一步地，所示試劑盒中還包括由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，以及由5'-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物。

進(jìn)一步地，所述試劑盒中還包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：