[發(fā)明專利]一種高表達(dá)安絲菌素P-3的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210249407.9
• 申請(qǐng)日: 2012-07-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102732581A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉彥君;王群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交聯(lián)藥物研發(fā)有限公司;蘇州康聚生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P17/18
• 分類號(hào): C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從珍貴橙色束絲放線菌制備安絲菌素P-3的方法。

背景技術(shù)

安絲菌素(Ansamitocin)是一種微管蛋白抑制劑。它通過(guò)與微管蛋白的結(jié)合從而拮抗微管蛋白組裝，其作用位點(diǎn)與長(zhǎng)春花堿相同。他的細(xì)胞毒性傳統(tǒng)化療藥物長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤和柔紅霉素的100-1000倍。安絲菌素的母核是大環(huán)內(nèi)酯類美登醇，其同系物包括植物來(lái)源的美登素和美登普林等。

已發(fā)現(xiàn)幾種放線菌可以表達(dá)安絲菌素，包括珍貴橙色束絲放線菌，主要產(chǎn)物為6種安絲菌素同系物，包括安絲菌素P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4、P-4’，結(jié)構(gòu)如下式所示：

主要區(qū)別為C-3位羥基上酯基的不同，通常作為前體化合物用于合成其他美登木素化合物，如美登素1（DM1）。美登木素類化合物因其強(qiáng)細(xì)胞毒性而在腫瘤治療領(lǐng)域受到極大關(guān)注，但是因?yàn)閺?qiáng)烈的毒副作用臨床失敗。目前臨床上通過(guò)交聯(lián)技術(shù)將美登木素生物堿（maytansinoids）與抗體交聯(lián)靶向治療取得了積極的療效和較低的毒副作用。美登木素類物質(zhì)在植物中的含量極低，植物提取的效率低、成本高；美登素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，全合成的收率低、成本高，不具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；因此需要通過(guò)生物發(fā)酵分離其前體化合物，再進(jìn)一步合成美登木素。安絲菌素P-2、P-3通常是所有安絲菌素中表達(dá)較高的，安絲菌素P-3結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、疏水性強(qiáng)易于萃取，是合成美登素的最佳前體，安絲菌素P-3的選擇性高表達(dá)有利于降低美登素的制備成本，同時(shí)減少雜質(zhì)的產(chǎn)生，利用藥品制備。

通過(guò)珍貴橙色束絲放線菌(CPCC260982、ATCC31281，屬名:Actinosynnema,)制備安絲菌素的工藝已經(jīng)有研究。美國(guó)專利US4331598和US4450234中，珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的安絲菌素主要是AP-1、AP-2、AP-3、AP-3′、AP-4和AP-4'，都可以通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)變成美登木素生物堿，用于醫(yī)療用途。通常珍貴橙色束絲放線菌表達(dá)的安絲菌素總量一般在10-50mg/L，AP-3一般占比不到50%。且由于表達(dá)物為多種安絲菌素混合物，還有不少不希望產(chǎn)生的安絲菌素，如N-脫甲基、20-O-脫甲基以及19-脫氯處被修飾的產(chǎn)物，在還原性脫酰作用下這些安絲菌素不會(huì)變成美登木醇。不利于將來(lái)進(jìn)行化學(xué)改造成美登木生物堿。

安絲菌素的總產(chǎn)量一般在10-50mg/L范圍，產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，且為多種安絲菌素同系物的混合物，不易分離。典型地，通過(guò)多步驟工藝回收并提純安絲菌素，如AP-3，往往需要經(jīng)過(guò)有機(jī)物萃取、重結(jié)晶、硅膠/氧化鋁層析和析晶進(jìn)一步提純獲得。

安絲菌素分離純化工藝繁瑣且涉及諸多的有毒的有機(jī)溶劑步驟，進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)非常困難，且成本較高，因此提高最終目標(biāo)物，安絲菌素，特別是主要產(chǎn)物AP-3的表達(dá)量，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)意義。尋找高表達(dá)的菌株或通過(guò)發(fā)酵工藝改進(jìn)提高安絲菌素的總表達(dá)量以及單一安絲菌素的占比對(duì)于安絲菌素的生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種珍貴橙色束絲放線菌(CPCC260982)發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素的方法，該方法可以高表達(dá)安絲菌素P-3。

本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，選用珍貴橙色束絲放線菌，通過(guò)合理的發(fā)酵培養(yǎng)基成分的配比、發(fā)酵溫度、溶氧和pH的控制實(shí)現(xiàn)安絲菌素的高表達(dá)和單一成分安絲菌素P-3占比的提升，使安絲菌素P-3的表達(dá)量達(dá)到100mg/L以上，其中安絲菌素P-3占全部安絲菌素比例在70%以上。

本發(fā)明提供一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，包括如下步驟：

用珍貴橙色束絲放線菌（CPCC260982）在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有2-10%的碳源、1-5%的氮源和0.1-2%的短鏈脂肪醇；發(fā)酵過(guò)程的pH值為6.5-7.5；溫度為26-30℃；溶氧控制20%以上；

所述的碳源選自葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、麥芽提取物或甘油中的一種或兩種以上。

所述的氮源選自蛋白胨、牛肉湯、酵母提取物、KNO₃、大豆粉、大豆胨、玉米漿、棉籽餅粉或棉籽餅浸出粉中的一種或兩種以上。

所述的短鏈脂肪醇選自正丙醇、異丙醇、正丁醇或異丁醇。

所述的在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是靜止、振蕩、通氣浸沒(méi)等。為在大容量的發(fā)酵器中較好的培養(yǎng)珍貴橙色束絲放線菌并實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量，優(yōu)選通氣浸沒(méi)培養(yǎng)。

pH值優(yōu)選7.0；溫度優(yōu)選28度；溶氧優(yōu)選控制30%以上。

發(fā)酵的典型時(shí)間為120h至360h。