[發(fā)明專利]一種多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒及其使用方法與應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102732637A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孔北華;張青
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多重巢式甲基化特異性PCR（MN-MSP）檢測試劑盒及其使用方法，以及在檢測卵巢癌，特別是早期卵巢癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌癥死亡女性患者3％。卵巢癌90%以上為上皮性卵巢癌，發(fā)病隱匿，臨床確診時約80％患者疾病已為晚期，預(yù)后差。晚期卵巢癌（FIGOⅡ-Ⅳ期）患者5年生存率僅為30～45％，而早期卵巢癌（FIGOⅠ期）患者5年生存率高達90％以上。因此，除積極尋找新的有效的治療方式外，探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制，研發(fā)新型卵巢癌早期診斷技術(shù)迫在眉睫。

現(xiàn)有技術(shù)中尚無簡便有效的、精確的、可常規(guī)用于卵巢癌早期診斷的檢測方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌標(biāo)志物，但僅有50～60％的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特異性較差，卵巢癌陽性預(yù)測值僅有10%~35%。總體而言，對于血清CA125檢測、經(jīng)陰道超聲探查等傳統(tǒng)的早期診斷方法單一或聯(lián)合應(yīng)用，目前均無證據(jù)顯示可降低人群的卵巢癌發(fā)病率和（或）病死率。其主要原因在于這些方法的假陰性或假陽性率均過高，敏感性和特異性達不到臨床需要。

DNA甲基化即未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine,CpG)二核苷酸發(fā)生甲基化，是重要的表觀遺傳學(xué)機制，是腫瘤抑制基因失活的關(guān)鍵機制之一，在某些情況下可能是唯一的機制。目前研究已證實原發(fā)性卵巢癌可有多種抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌顯示出CpG島甲基化表型。作為癌癥發(fā)生的早期事件，抑癌基因DNA異常甲基化檢測可以在患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)或者影像學(xué)證據(jù)之前做到分子診斷，為卵巢癌的早期診斷提供了新的途徑。

目前，研究已證實癌癥患者血清富含腫瘤DNA（Serum?free?circulating?DNA，SfcDNA），可用于癌癥分子生物學(xué)診斷。使用體液標(biāo)本（血清、尿液等）檢測其中游離腫瘤特異DNA在其他癌癥如肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等已被證實可行。更為重要的是，腫瘤游離DNA不僅在晚期轉(zhuǎn)移癌癥患者血清內(nèi)存在，對于早期患者，血清內(nèi)同樣可檢測到腫瘤游離DNA，研究認為其來源于侵入體內(nèi)循環(huán)但無浸潤機體實質(zhì)器官能力的腫瘤細胞，或是由凋亡腫瘤細胞釋放進入體內(nèi)循環(huán)。因此，利用血清游離DNA（SfcDNA）進行癌癥的早期分子生物學(xué)診斷是當(dāng)前研究的一大熱點。

雖然國內(nèi)外研究者利用卵巢癌患者血清游離DNA甲基化檢測，在卵巢癌早期診斷中的研究取得了令人振奮的進步，但是在實際操作過程中存在以下局限性：1、血清游離DNA微量（正常人濃度平均為：0.03ug/ml，腫瘤患者濃度平均為0.18ug/ml），并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的難度，降低了臨床檢測的敏感性和特異性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法為甲基化特異性PCR（Methylation?Specific?PCR,MSP），其操作繁瑣，DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后丟失嚴重，一般只用于單個基因檢測，特異性和敏感性均較低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不確定性及血清游離DNA的局限性，導(dǎo)致單一卵巢癌甲基化標(biāo)記物檢測無法滿足臨床要求。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種多重巢式甲基化特異性PCR（MN-MSP）檢測試劑盒及其使用方法，以及其在檢測卵巢癌，特別是早期卵巢癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的多重巢式甲基化特異性PCR（MN-MSP）檢測技術(shù)，在國內(nèi)外首次將多重PCR（Multiplex?PCR）、巢式PCR（Nested?PCR）與甲基化特異性PCR（MSP）相結(jié)合，利用課題組開發(fā)的引物設(shè)計軟件設(shè)計全新的PCR引物，并模擬整個PCR過程，避免PCR過程中引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等的形成，同時創(chuàng)新性的應(yīng)用兩步爬坡緩慢退火（Ramping?anneal）的方法，保證引物與模板結(jié)合的特異性，最大限度地克服了血清游離DNA微量及單一甲基化標(biāo)記物敏感性、特異性不高的缺點，可實現(xiàn)最低達1/8000ug?DNA（約相當(dāng)于19個基因組DNA）中7個目的基因甲基化狀態(tài)的高效檢測，并經(jīng)臨床標(biāo)本反復(fù)驗證，對現(xiàn)有檢測技術(shù)提供了有力補充，成為一種有效的早期卵巢癌診斷檢測手段。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒，由以下物質(zhì)組成：