[發明專利]利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達PCV 2 Cap蛋白的方法

無效

• 申請號: 201210248620.8
• 申請日: 2012-07-18
• 公開（公告）號: CN102839195A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 樊惠英;廖明;陳春麗;葉昱;張杰
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 楊曉松;裘暉

1.一種利用pFast?Bac?Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）抽提PCV2病毒的DNA；根據PCV2ORF2的序列設計引物，擴增得到帶有His標簽的編碼PCV2Cap蛋白的基因片段；

（2）將步驟（1）擴增得到的基因片段連接到pFast?Bac?Dual質粒上，獲得重組轉移質粒pFast?Bac-p10-ORF2-pH-ORF2；

（3）將重組轉移質粒pFast?Bac-p10-ORF2-pH-ORF2轉化大腸桿菌DH10Bac，發生轉座作用，經藍白斑篩選后得到含有ORF2基因的重組穿梭載體Bac-p10-ORF2-pH-ORF2；

（4）以脂質體介導的方法將重組穿梭載體Bac-p10-ORF2-pH-ORF2轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒Ac.Dual-Cap；

（5）將重組桿狀病毒Ac.Dual-Cap接毒于昆蟲細胞，培養后收集昆蟲細胞，重組Cap蛋白在昆蟲細胞的細胞核和細胞質中獲得表達；將表達產物純化后得到重組Cap蛋白；

步驟（1）所述引物的序列為：

P10F：5’–CCATGGATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’；

P10R：5’-TGCAGGTACCTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT-3’；

PHF：5’-GGATCCATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’；

PHR：5’-CGCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3’；

步驟（5）所述的純化是用NI-NTA樹脂純化。

2.根據權利要求1所述的利用pFast?Bac?Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法，其特征在于：步驟（2）所述的將步驟（1）擴增得到的基因片段連接到pFast?Bac?Dual質粒上，是將步驟（1）擴增得到的基因片段分別插入pFast?Bac?Dual質粒p10啟動子下游的NcoI、KpnI克隆位點和pH啟動子下游的BamHI、HindIII克隆位點。

3.根據權利要求1所述的利用pFast?Bac?Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法，其特征在于：步驟（4）和（5）所述的昆蟲細胞為Sf9昆蟲細胞。