[發(fā)明專利]一種多重巢式甲基化特異性PCR擴增引物及其使用方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210248105.X
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102732516A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設計）人: 孔北華;張青
• 申請（專利權）人: 山東大學齊魯醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

1.一種多重巢式甲基化特異性PCR擴增引物，其特征在于：包括針對7種目的基因APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5和OPCML的引物組，其核苷酸序列如SEQ?IDNO.1～42所示。

2.權利要求1所述的多重巢式甲基化特異性PCR擴增引物的使用方法，其特征在于：步驟如下：

（1）血清游離DNA的提取：取患者血清，提取DNA，得DNA溶液；

（2）血清游離DNA甲基化修飾：取DNA溶液，進行甲基化修飾，得修飾后DNA溶液；

（3）PCR檢測：

Step1：PCR反應體系------Outside：

模板：1ul------修飾后DNA溶液；

引物：1ul------7種目的基因Outside?Primer按照等比例混合；

MIX：10ul；

Enhancer：2ul；

ddH₂O：6ul；

PCR反應條件------Outside：

Step2：PCR反應體系------Inside：

模板：1ul------取Step1產物DNA1ul；

引物：1ul------7種目的基因Inside?Primer按照等比例混合；

MIX：10ul；

Enhancer：2ul；

ddH₂O：6ul；

PCR反應條件------Inside：

（4）PCR結果判斷：取Step2所得產物10ul，4%瓊脂糖凝膠中150v電泳90min，凝膠放置凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析，肉眼判斷反應結果：

①若M體系中出現(xiàn)任一陽性條帶，判定結果為陽性；

②若M體系中無陽性條帶，U體系中出現(xiàn)任一陽性條帶，判定結果為陰性；

③若M、U體系中均無陽性條帶，判定送檢血清不合格，重新送檢。

3.權利要求1所述的多重巢式甲基化特異性PCR擴增引物在早期卵巢癌診斷中的應用。