[發明專利]一種單端孢霉烯B族毒素的合成方法

有效

• 申請號: 201210246635.0
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN103421857A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 袁宗輝;汪瀟;萬丹;黃玲利;潘源虎;王玉蓮;陳冬梅;陶燕飛;謝書宇;戴夢紅;王旭;彭大鵬;郝海紅;程古月;劉振利
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C07D493/10;C12R1/77
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種單端孢霉烯B族毒素特別是三乙酰基脫氧血腐鐮刀菌烯醇毒素（3Ac-DON）和脫氧血腐鐮刀菌烯醇毒素（DON）的生物合成方法，其特征在于，通過控制溫度培養，在產毒高峰期進行萃取和柱層析分離得3Ac-DON毒素，將所得3Ac-DON毒素進一步經堿水解得到DON毒素；

其中：3Ac-DON毒素制備步驟如下所述：

（1）菌種復蘇、孢子液制備及大米接種培養

菌種復蘇：生產菌種為禾谷鐮刀菌Fusarium?graminearum?DSM?No.4528，將該菌的菌粉在無菌蒸餾水下室溫復水一夜后，接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，在10-30℃下培養4-10天；

分生孢子液制備：取培養4-10天的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，挑取菌絲至分生孢子培養基，在光照強度為1000lux，15-30℃，200rpm搖床培養3-5天；

大米接種培養：將搖床培養3-5天后的分生孢子液，接種到在121℃高壓蒸汽下每次滅菌30分鐘，每天一次和滅菌兩天后的大米產毒培養基中，接種后置于28℃黑暗下培養7-9天；

（2）大米培養物3Ac-DON毒素的提取分離，其步驟包括：

固液萃取：向培養后的大米培養基中加入2-3倍體積的甲醇水溶液，并攪拌均勻，浸泡靜置3天；

液液萃取：將浸泡3天后的甲醇液抽濾，收集甲醇液，旋轉蒸發去除甲醇相，收集蒸去甲醇相后的渾濁水相采用氯化鈉飽和過夜，濾去不溶沉淀，將過濾后的水相加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液蒸干，收集所得3Ac-DON粗毒素；

柱層析：用少量乙酸乙酯溶解上步粗毒素后上樣，用石油醚丙酮洗脫，每隔30mL收集，以DON毒素化學標準品為對照，收集含有3Ac-DON毒素單一染色點部分，旋轉蒸干；

結晶：將蒸干后的3Ac-DON毒素單一部分采用少量石油醚丙酮溶解，放入4℃冰箱，靜置過夜，待白色晶析出，收集放入真空干燥器干燥，即獲得純度不低于95%的3Ac-DON毒素結晶；

所述的DON毒素制備方法是：將步驟（2）所得的3Ac-DON毒素進行堿水解，其步驟包括：

堿水解：將3Ac-DON晶體溶解于甲醇中，向其中逐滴滴加0.5mol/L?NaOH，并用薄層色譜監測反應過程，待3Ac-DON完全水解后停止，用1mol/L檸檬酸調至中性；

結晶：將反應液旋轉蒸干，加入少量蒸餾水稀釋，用乙酸乙酯萃取3次，DON即在乙酸乙酯層；將蒸干后的DON毒素單一部分采用少量乙酸乙酯溶解，放入4℃冰箱，靜置過夜，待白色晶析出，收集放入真空干燥器干燥，干燥條件為真空度-0.1MPa，40℃,24-48h，即獲得含量≥92.58%的DON毒素結晶。