[發(fā)明專利]用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列的引物組、試劑盒及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210242407.6
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN102766624A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉唐書;肖維威;張寶;周琳華;佘之韻;朱文亮;梁宇斌
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

1.轉(zhuǎn)基因玉米Bt176及其加工品的檢測引物組，包括引物組1和引物組2，其中，引物組1包括外引物zSSIIb-F3、zSSIIb-B3和內(nèi)引物zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下：

zSSIIb-?F3：TGACCGTTAGCAATGGCTAC（SEQ?ID?NO:1）；

zSSIIb-?B3：AGCGTCTCGAACGTGTAGT（SEQ?ID?NO:2）；

zSSIIb-FIP：ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA（SEQ?ID?NO:3）；

zSSIIb-BIP：?CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG（SEQ?ID?NO:4）；

引物組2包括外引物Bt176-F3、Bt176-B3和內(nèi)引物Bt176-FIP、Bt176-BIP，序列如下：

Bt176-F3：CGGCTTCAAGCACGGGA（SEQ?ID?NO:5）；

Bt176-B3：GAGGGAGAGAGAGGGAGC（SEQ?ID?NO:6）；

Bt176-FIP：AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT（SEQ?ID?NO:7）；

Bt176-?BIP：TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG（SEQ?ID?NO:8）。

2.轉(zhuǎn)基因玉米Bt176及其加工品的檢測試劑盒，包括：（1）權(quán)利要求1所述的引物組1；（2）權(quán)利要求1所述的引物組2；（3）Bst?DNA聚合酶；（4）LAMP反應(yīng)液；（5）染色劑；（6）內(nèi)對照；（7）陽性對照。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，引物組1中外引物和內(nèi)引物的添加摩爾比為1:8；所述引物組2中外引物和內(nèi)引物的添加摩爾比為1:8。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的LAMP反應(yīng)液，由0.?2?mol/L?Mg₂SO₄、25?mmol/L?dNTP、10×Bst?buffer、5?mol/L?甜菜堿按1：4：10：20的比例配比而成。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述染色劑為SYBR?Green。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的內(nèi)對照為含有玉米內(nèi)參照基因zSSIIb（SEQ?ID?NO:9）的重組質(zhì)粒；所述陽性對照為含有轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列（SEQ?ID?NO:10）的重組質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，內(nèi)對照和陽性對照的重組質(zhì)粒的載體為pMDl8-T載體。

8.利用權(quán)利要求2的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176及其加工品的方法，包括如下步驟：

（1）提取純化待檢樣品DNA；

（2）LAMP法檢測；

?LAMP法檢測zSSIIb基因：設(shè)置樣品管（加樣品DNA）、內(nèi)對照（加含有zSSIIb基因的重組質(zhì)粒DNA）、空白對照（加滅菌去離子水），?25μL反應(yīng)體系含有：引物組1外引物對0.2μmol/L，內(nèi)引物對1.6μmol/L?，Bst?DNA聚合酶0.32U/μL，LAMP反應(yīng)液9μL，待檢樣品DNA50ng，用滅菌去離子水補齊到25μl；將配制好的反應(yīng)管混勻后離心，并于65℃反應(yīng)50min，并在80℃持續(xù)10min；反應(yīng)完畢后，往反應(yīng)管中加入染色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷待檢樣品中是否含有zSSIIb基因；

LAMP法檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列：設(shè)置樣品管（樣品DNA）、陽性對照（含有轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列的重組質(zhì)粒DNA）、空白對照（滅菌去離子水），?25μL反應(yīng)體系含有：引物組2外引物對0.2μmol/L，內(nèi)引物對1.6μmol/L?，Bst?DNA聚合酶0.32U/μL，反應(yīng)液9μL，待檢樣品DNA50ng，用滅菌去離子水補齊到25μl；將配制好的反應(yīng)管混勻后離心，并于65℃反應(yīng)50min，并在80℃持續(xù)10min；反應(yīng)結(jié)束后，往反應(yīng)管中加入染色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷待檢樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列；

（3）結(jié)果判斷：如果步驟（2）中內(nèi)對照、陽性對照呈陽性，空白對照呈陰性，而樣品zSSIIb基因檢測呈陽性、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列檢測呈陽性，則表明待檢樣品含有轉(zhuǎn)基因玉米Bt176成分。