[發明專利]一種Thermus脂肪酶的固定化方法

無效

• 申請號: 201210241464.2
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN102994491A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 章曉波;宋崇富
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N9/20;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述方法為：將氨基化納米磁性載體Fe₃O₄/SiO₂與pH8.0的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，再加入以所述Tris-HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus?thermophilus?WL）的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3.5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法獲得：將序列號為AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大腸埃希氏桿菌為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC?NO：1.12252；將含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC?NO：1.12252的單菌落接種于LB液體培養基中，37℃、250rpm培養4h，獲得培養液a，取培養液a以體積分數1%的接種量接種于新鮮LB液體培養基中，37℃、250rpm培養3h，獲得培養液b，在培養液b中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.5mM，37℃下培養4h，離心，將沉淀b加入pH7.9的Buffer?A緩沖液中，在10KHz頻率下進行超聲裂解，離心，取上清液b進行Ni柱親和層析，洗脫液經透析后，取截留液冷凍干燥，獲得所述Thermus脂肪酶。

2.如權利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述氨基化納米磁性載體Fe₃O₄/SiO₂按如下方法制備：（1）將氯化鐵和氯化亞鐵以物質的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮氣氛圍中，將混合液在30℃下攪拌5min后，依次逐滴滴加質量濃度25%的氨水溶液a和聚乙二醇，滴加完畢后，在60℃條件下繼續通入氮氣反應30min后，將反應液在53KHz下超聲分散5min，室溫下自然冷卻至25℃后進行磁分離，取沉淀c用超純水洗滌至中性后干燥，獲得Fe₃O₄納米顆粒；所述水的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為4600ml/mol；所述氨水溶液a的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為400ml/mol，所述聚乙二醇的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為200ml/mol；所述聚乙二醇的分子量為4000；（2）將Fe₃O₄納米顆粒與無水乙醇、水和質量濃度25%的氨水溶液b混合，在53KHz下進行超聲分散1h，然后在室溫下攪拌，同時緩慢滴加正硅酸乙酯，滴加完畢后室溫反應12h，反應完畢后，將反應液進行磁分離，沉淀d用蒸餾水洗滌至中性，再將洗滌后的沉淀d在1mol/L的鹽酸中室溫浸泡12h，磁分離，去除鹽酸后將沉淀e水洗至中性，干燥，獲得Fe₃O₄/SiO₂復合顆粒；所述無水乙醇、水的體積用量以Fe₃O₄納米顆粒質量計分別為80ml/g、20ml/g，所述的氨水溶液b體積用量以Fe₃O₄納米顆粒質量計為2.5ml/g；所述正硅酸乙酯的體積用量以Fe₃O₄納米顆粒質量計為1.5ml/g；（3）將Fe₃O₄/SiO₂復合顆粒加入無水乙醇中，在53KHz下超聲分散1h后，加入質量濃度25%的氨水溶液c繼續在53KHz下超聲分散10min，然后通入氮氣保護，在攪拌的條件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，同時在50℃反應8h，反應結束后將反應液在室溫下自然冷卻至25℃，磁分離，沉淀用蒸餾水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌后干燥，獲得所述氨基化納米磁性載體Fe₃O₄/SiO₂；所述Fe₃O₄/SiO₂復合顆粒與無水乙醇、氨水溶液c和3-氨丙基三乙氧基硅烷的質量體積比分別為1：60、1：6、1：4。