[發(fā)明專利]下調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)的siRNA及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210241285.9
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103540591A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳虎;張曉穎;張斌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02;A61P29/00;C12N5/0783;A61K35/12;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 程泳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及小干擾RNA分子及其用途，特別是能夠下調(diào)鋅指蛋白A20的小干擾RNA（siRNA）分子，以及所述siRNA分子用于下調(diào)鋅指蛋白A20、促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟和用于制備治療急性髓性白血病的免疫細(xì)胞或藥物的用途。?

背景技術(shù)

急性髓性白血病（Acute?myeloid?leukemia，AML）是一類我國常見且預(yù)后很差的惡性血液病腫瘤，目前仍有大量病人對常規(guī)治療（化療，造血干細(xì)胞移植，生物靶向治療等）不敏感或治療后復(fù)發(fā)，其中白血病微小殘留病灶（Minimal?residual?disease，MRD）是治療復(fù)發(fā)的主要障礙^［1-2］。近年來，腫瘤的細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤治療模式，并以安全有效，副作用小等優(yōu)點(diǎn)逐漸被廣大的醫(yī)務(wù)工作者和患者認(rèn)可^［3］。目前認(rèn)為AML病人在化療或者造血干細(xì)胞移植治療后，輔以特異的個(gè)體化生物免疫治療，有利于抑制或者消除殘留白血病（MRD），延緩復(fù)發(fā)，取得良好的預(yù)后^［4］。在AML細(xì)胞生物免疫治療中，以樹突狀細(xì)胞（Dendritic?cell，DC）遞呈腫瘤抗原誘導(dǎo)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫的腫瘤生物治療已成為目前臨床試驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。?

樹突狀細(xì)胞(Dendritic?cell,DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，具有攝取、加工抗原，以MHCⅠ、Ⅱ類肽結(jié)合物的形式遞呈抗原并促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖的能力，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著極其重要的作用。隨著對DC攝取、遞呈抗原機(jī)理的不斷認(rèn)識(shí)，DC培養(yǎng)方法的不斷成熟和完善，針對腫瘤的弱免疫原性、抗原調(diào)變現(xiàn)象、MHC分子下調(diào)或缺失、抗原加工遞呈障礙等免疫特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的DC疫苗已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。這些發(fā)展為開辟腫瘤的生物治療新途徑奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前應(yīng)用比較多的是DC主要來源于正常細(xì)胞，即供者正常外周血和病人治療緩解期正常造血狀態(tài)下分離的DC細(xì)胞。但是正常細(xì)胞（包括供者）來源的DC也存在諸多不足：1：來源較少，不能滿足臨床需要；2:制備過程中需要抗原負(fù)載?步驟；3:容易引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)等問題^［5-6］。有研究者發(fā)現(xiàn)了AML病人本身的AML腫瘤細(xì)胞也能誘導(dǎo)出DC樣的細(xì)胞（即AML-DC），并應(yīng)用于臨床，因此我們進(jìn)行生物免疫治療所采用的細(xì)胞也包括AML-DC。?

AML-DC的發(fā)現(xiàn)：1998年奧地利學(xué)者Oehler在研究粒細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn)在較高純度的乳鐵蛋白存在的條件下，晚幼粒細(xì)胞的發(fā)育途徑可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在GM-CSF、IL-4和TNF-α存在的條件下，顛倒粒細(xì)胞成熟路徑可以產(chǎn)DC樣細(xì)胞，具有DC細(xì)胞的形態(tài)和表型，甚至有抗原遞呈能力^［7］。這為我們提供了利用髓性腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生DC的機(jī)會(huì)。近些年來研究的比較成功的是CML-DC和AML-DC^［8］。CML-DC成熟度較高，能有效刺激同種異體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，并在臨床中有了一定的應(yīng)用^［9］。通過體內(nèi)擴(kuò)增AML-DC，發(fā)現(xiàn)其表型和功能存在缺陷，并且分化不夠徹底，去除誘導(dǎo)劑后會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，不成熟的DC會(huì)誘導(dǎo)免疫耐受。但是AML-DC具有來源豐富，不需要抗原負(fù)載和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因此具有潛在的應(yīng)用前景^［10］。?

如何能夠彌補(bǔ)AML-DC缺陷，使之應(yīng)用于臨床，應(yīng)用的較多的有在培養(yǎng)過程中加入CD40配體，SCF，Ca2+等，但是由于AML-DC存在個(gè)體差異較大，沒有一種方法能夠做到簡單適宜通用，如何更有效的促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，是亟待解決的技術(shù)問題^［11-13］。?

A20（tumor?necrosis?factor,alpha-induced?protein3,TNFAIP3）是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的泛素修飾酶，它有兩個(gè)泛素編輯區(qū)(Two?ubiquitin-editing?domains)：N末端去泛素化酶保護(hù)受體相互作用蛋白（RIP）免于降解；C末端泛素化連接酶促進(jìn)RIP降解（A20結(jié)構(gòu)見圖1）^［14］。這使得A20具有兩種不同的生物學(xué)效應(yīng)，即是否泛素化來調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵分子的降解^［15］。近年來的研究表明A20能夠通過抑制TNF和TLR（Toll-like?receptor）這兩條激活途徑來影響NF-κB生物活性。其主要機(jī)制如下：?