[發明專利]表達多個目的基因的植物表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201210241109.5
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN102757978A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 董研;楊敏生
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 葉凡

1.表達單個或多個目的基因的植物表達載體，其特征在于，包括：植物轉化載體p1354、克隆載體p1964A和待轉化的一個或多個目的基因。

2.按照權利要求1所述的植物表達載體，其特征在于：所述植物轉化載體p1354源自載體pCAMBIA1301，通過在pCAMBIA1301載體的BamH?I與EcoR?I兩個酶切位點之間引入一個帶有Bsp120?I酶切位點的片段構建得到；

所述克隆載體p1964A起源于克隆載體pUCm-T；p1964A載體帶有CaMV?35S啟動子及NOS終止序列，在CaMV?35S啟動子和NOS終止序列之間有2個XcmI酶切位點；p1964A載體攜帶有Not?I與Bsp120?I、Spe?I及Nhe?I酶切位點。

3.按照權利要求1或2所述的植物表達載體，其特征在于：所述的目的基因是殺蟲毒蛋白基因BtCryIA或/和殺蟲毒蛋白基因BtCryIIIA。

4.一種構建權利要求1或2所述的植物表達載體的方法，包括以下步驟：

（1）分別構建植物轉化載體p1354和克隆載體p1964A；

（2）用內切酶Xcm?I酶切克隆載體p1964A產生2個含T的3’突出端，形成T載體，與帶有含A的3’突出端的第1個目的基因PCR產物相連，將第1個目的基因擴增片段完整并正向連入克隆載體中，構建成包括CaMV35S啟動子+第1個目的基因+NOS終止序列的開放閱讀框；利用Not?I與Nhe?I雙切攜帶第1個目的基因表達開放閱讀框的克隆載體，回收第1個目的基因表達開放閱讀框片段，備用；

（3）利用Bsp120?I與Xba?I雙切植物轉化載體p1354，回收p1354的酶切片段；將p1354的酶切片段與步驟（2）回收的第1個目的基因表達開放閱讀框片段連接；新合成的植物表達載體上帶有的Bsp120I與SpeI位點經過酶切又與第2個帶有Not?I與Nhe?I位點的目的基因表達開放閱讀框片段相連，如此不斷重復，構建出攜帶多個目的基因的植物表達載體。

5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的植物轉化載體p1354的構建方法包括：在pCAMBIA1301載體的BamH?I與EcoR?I兩個酶切位點之間引入一個帶有Bsp120?I酶切位點的片段，即得。

6.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述克隆載體p1964A的構建方法包括：從載體pCAMBIA1302上克隆帶有CaMV?35S啟動子、GFP綠色熒光蛋白基因及NOS終止序列并引入了新酶切位點的片段；用一個兩端都帶有Xcm?I位點的片段取代GFP綠色熒光蛋白基因，形成一個新片段，把新片段連到pUCm-T上得到克隆載體p1964A。

7.含有權利要求1或2所述的植物表達載體的宿主細胞。

8.按照權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于：所述的宿主細胞是植物細胞。

9.權利要求1或2所述的植物表達載體將目的基因轉化到植物細胞或組織中的應用。

10.按照權利要求9所述的應用，其特征在于：所述的目的基因包括殺蟲毒蛋白基因BtCryIA或/和殺蟲毒蛋白基因BtCryIIIA。