[發明專利]噬菌體TSP4 dCTP脫氨酶和編碼脫氨酶的多核苷酸

無效

• 申請號: 201210240770.4
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN102766617A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 林連兵;高婷婷;李秋鵬;魏云林;季秀玲;張琦
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12R1/92
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本發明涉及噬菌體TSP4?dCTP脫氨酶和編碼解旋酶的多核苷酸，dCTP脫氨酶為生物體中與核酸代謝相關的酶類，屬于生物技術領域。?

背景技術

dCTP脫氨酶是指催化dCTP進行脫氨作用，生產dUTP和NH₃的一類酶類，屬于dUTPase家族，其催化的反應方程式為：?dCTP?+?H₂O=?dUTP?+?NH₃。

dCTP脫氨酶廣泛存在于細菌、真核和古菌中，能催化水解dCTP生成dUTP，dUTP在dUTPase的催化下生成dUMP和焦磷酸，dUMP是胸苷酸合成酶途徑中dTTP合成的前體這一系列過程降低了細胞內dUTP/dTTP的比例，阻止了dUTP進入DNA，從而減少DNA的突變幾率，dCTP脫氨酶是這些過程的重要催化酶類，其可以應用于dUTP，dUMP及dTTP的合成過程，其核苷酸序列可以用于構建能催化形成以上產物的基因工程菌株。

高溫菌噬菌體TSP4為感染高溫菌菌株Thermus?TC16的一種高溫病毒，李秋鵬（昆明理工大學碩士論文，2009）對該噬菌體基因組進行了初步的解析，本申請通過序列檢索分析獲得TSP4噬菌體dCTP脫氨酶的序列，該序列與來自于高溫菌的P74-26的dCTP脫氨酶的核苷酸序列相似性為66%，該病毒分離自俄羅斯堪察加半島的熱泉，與已發表的其他dCTP脫氨酶核苷酸序列的相似性均在37%以下，為新的dCTP脫氨酶。來自于高溫菌的P74-26的dCTP脫氨酶的核苷酸序列僅通過生物信息學預測其功能，未通過實驗證明其具有生物學功能特征。

發明內容

本發明旨在提供一種TSP4噬菌體dCTP脫氨酶，其具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序。

本發明另一目的是提供一種編碼噬菌體TSP4?dCTP脫氨酶的多核苷酸，其具有SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列及其互補序列。

本發明的另一個目的是提供含有編碼dCTP脫氨酶的多核苷酸的重組載體，其是由前文所述的多核苷酸與質粒、病毒或運載體表達載體構建而成的重組載體。

本發明的有益效果：

本發明獲得的dCTP脫氨酶，可特異的催化dCTP產生不可逆的脫氨反應，在核酸代謝中起著重要的作用，其可以應用于dUTP，dUMP及dTTP的工業合成過程，因其來源于高溫噬菌體，使其具有較為特殊的高溫催化能力及較高的熱穩定性；其核苷酸序列可以用于構建能催化形成以上產物的基因工程菌株。

附圖說明

圖1是本發明dCTP脫氨酶基因的克隆片段電泳示意圖；

圖2是本發明dCTP脫氨酶基因保守結構域分析示意圖；

圖3是本發明重組質粒回收電泳圖和質粒酶切圖譜，其中：泳道1為Marker；泳道2為pET-32a(+)質粒，其大小為5900bp；泳道3為dCTP脫氨酶膠回收產物，其大小為564bp；泳道4為dCTP-pET-32a重組質粒；泳道5為dCTP-pET-32a重組質粒雙酶切；

圖4是本發明dCTP脫氨酶基因表達蛋白的SDS-PAGE分析檢測電泳圖，其分子量約為42000道爾頓，其中：泳道1為Protein?Marker；泳道2為Rosetta-pET-32a誘導前；泳道3為Rosetta-pET-32a誘導后；泳道4為Rosetta-dCTP-pET-32a誘導前；泳道5為Rosetta-dCTP-pET-32a誘導后；

圖5是本發明dCTP脫氨酶基因表達蛋白的可溶性分析SDS-PAGE檢測電泳圖，其中：泳道1為Protein?Marker；泳道2為Rosetta-pET-32a誘導前；泳道3為Rosetta-pET-32a誘導后；泳道4為Rosetta-dCTP-pET-32a誘導后上清；泳道5為Rosetta-dCTP-pET-32a誘導后沉淀；

圖6是本發明dCTP脫氨酶蛋白純化SDS-PAGE分析檢測電泳圖，其中泳道1為Protein?Marker；泳道2為Rosetta-dCTP-pET-32a誘導表達上清液；泳道3為上樣后流穿液；泳道4為80mM咪唑洗脫液；泳道5為150mM咪唑洗脫液；泳道6為200mM咪唑洗脫液；泳道7和8為300mM咪唑洗脫液；泳道9和10為500mM咪唑洗脫液。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規試劑和使用常規方法。