[發明專利]棲熱菌TC16的單鏈DNA結合蛋白和編碼此蛋白的多核苷酸

無效

• 申請號: 201210240769.1
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN102766199A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 林連兵;何進;黃乃耀;魏云林;季秀玲;張琦
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12R1/01
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技術領域

?本發明屬于生物技術領域，涉及一種來源于棲熱菌TC16的單鏈DNA結合蛋白及編碼此蛋白的多核苷酸。?

背景技術

單鏈DNA結合蛋白（single-strand?DNA?blinding?protein，SSB），即結合在單鏈DNA上的一類蛋白，它參與所有生物中的大部分的細胞途徑。SSB（單鏈DNA結合蛋白）在DNA進行復制、轉錄及修復等生理過程中起著重要的角色，主要表現在于dsDNA（雙鏈DNA）解旋時結合在ssDNA（單鏈DNA）上，保障ssDNA的穩定，以防ssDNA重新配對成雙鏈或被核酸酶降解，從中對ssDNA起到相應的保護作用。除了對ssDNA二級結構的作用之外，SSB還促進同源的核苷酸鏈進行配對，另外，它們還被認識為可以修復和調整一些DNA生理代謝的關鍵蛋白。

SSB首先是在T4噬菌體上被證明的，隨后在細菌、古菌、真核生物及病毒中也普遍發現。在氨基酸水平上，SSB的進化上是表現為在不同有機體中較大地缺乏同源性，但有一個被視為典型的決定性因素——保守結構區域。這保守區域稱為寡核苷酸/寡糖結合位點折疊區（OB-fold），其涉及到核苷酸的結合點。

除了OB-fold之外，SSB還被認為是通過多聚體構型來構成功能蛋白形式。在真核生物中，最具有特征的SSB蛋白是人類的復制型蛋白A（RPA），其是通過三個緊密的亞基形成并總共提供6個OB-fold，其中4個參與和DNA的結合。在原核生物分支的真細菌SSB基本都是被具有高同源性的單基因編碼翻譯，如E.coli的SSB(SSBEC)，在代謝過程中，它們功能形式基本是以同源四聚體為主要構型，在這種構型下，每個單體提供1個OB-fold。在古細菌Crenarcheota中，報道了僅有一種類型的SSB，并僅含有一個OB-fold。與之相反，真核及可培養的古菌類的SSB是具有更多樣性的SSB，其具有一個或者幾個OB-fold。在棲熱菌中，SSB也是以多種構型結合在ssDNA上，每個單體基本擁有2個OB-fold，并且它們功能構型的種類是隨著核苷酸鏈的長度大小而發生變化。這表明在棲熱菌中，它們的SSB相比其它種類還具有更為多樣性的功能構型。

等溫PCR是一種DNA擴增技術，可以實現熱變性、雜交退火后，在恒定溫度下進行PCR。由于內切核酸酶V可以實現引物-模板復合物的循環再生，引發DNA合成反應，而單鏈DNA結合蛋白與解螺旋酶可提高等溫PCR效率，實現對目標核酸的大規模擴增，SSB對ssDNA是起到了保護作用及促進dsDNA的解鏈作用，?其是等溫PCR體系中的重要組分。

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發明內容

本發明的目的是提供一種棲熱菌TC16單鏈DNA結合蛋白，其具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。

本發明的另一目的是提供一種編碼棲熱菌Thermus?TC16單鏈DNA結合蛋白的多核苷酸，其具有SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列，或其具有與SEQ?ID?NO.2互補的核苷酸序列。

本發明同時提供含有編碼單鏈DNA結合蛋白的多核苷酸的重組載體及表達方法。

本發明的有益效果如下：

本發明獲得的單鏈DNA結合蛋白，可以在常溫和高溫下（20-80℃）和單鏈DNA結合，能應用于恒溫PCR作為擴增DNA反應體系的添加物，保護ssDNA的完整性，促進解旋酶的解旋效率，以達到提高擴增效率的結果。

附圖說明

???圖1是本發明棲熱菌TC16的單鏈DNA結合蛋白基因的PCR擴增產物電泳示意圖，其中：

M是Marker；1是TC16-SSB基因PCR產物；

圖2是本發明單鏈結合蛋白TC16-SSB的保守區域分析示意圖；

圖3是本發明單鏈結合蛋白TC16-SSB在含重組質粒的E.coli?BL21中的表達及純化；其中：泳道1是純化的單鏈結合蛋白TC16-SSB，泳道M是蛋白質分子量marker；

圖4是本發明不同濃度ssDNA與TC16-SSB結合的效果電泳示意圖，其中1是10pmol?ssDNA（35base）；2是10pmol?ssDNA+10μg?TC16-SSB；3是20pmol?ssDNA?；4是20pmol?ssDNA+10μg?TC16-SSB；

???圖5本發明不同濃度的TC16-SSB對ssDNA吸附效果電泳示意圖，其中1是2ul?ssDNA（39?base）；2是2ul?ssDNA+1ul?TC16-SSB；3是2ul?ssDNA+2ul?TC16-SSB；4是2ul?ssDNA+3ul?