[發(fā)明專利]利用慢病毒載體介導(dǎo)PLK1 RNAi在治療食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210240487.1
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN102719437A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙春玲;劉曉影;陳麗梅;高志芹;馮衛(wèi)國;杜長青
• 申請（專利權(quán)）人: 濰坊醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;A61K48/00;A61P35/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及到一種針對人PLK1基因RNAi的重組慢病毒載體的構(gòu)建及重組慢病毒的生產(chǎn)，并將這種重組慢病毒應(yīng)用于抑制食管鱗癌的轉(zhuǎn)移。

背景技術(shù)

在現(xiàn)有技術(shù)中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知PLK1?(Polo-like?kinase?1)是一種高度保守的哺乳動物細(xì)胞的絲氨酸/蘇氨酸激酶。PLK1在細(xì)胞有絲分裂的不同時期都起到十分重要的作用，對細(xì)胞周期的正常進(jìn)行、中心體成熟、胞質(zhì)分裂等均有重要影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)人類腫瘤中PLK1均表現(xiàn)為高表達(dá)，而且PLK1的過高表達(dá)在非小細(xì)胞性肺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤患者均提示預(yù)后不良。PLK1的高表達(dá)還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面beta1整合素的蛋白水平而誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。所有這些研究結(jié)果表明：PLK1有可能成為惡性腫瘤治療的新靶點。

目前，研究人員也紛紛開展了以PLK1為靶點的抗腫瘤藥物的研究。建立了針對PLK1?mRNA?的反義寡核苷酸，它能特異性地對PLK1mRNA及其蛋白產(chǎn)物表現(xiàn)為劑量依賴性的抑制作用，由此也抑制了PLK1的絲氨酸／蘇氨酸激酶活性，能有效抑制培養(yǎng)細(xì)胞系或裸鼠腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞的增殖，并且不影響人體正常腎小球系膜細(xì)胞和羊膜纖維母細(xì)胞的生長及生存能力。與PLK1結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子化合物抑制劑對高表達(dá)PLK1的腫瘤也起到一定的抑制作用。而靶向PLK1的干擾RNA作為腫瘤基因治療藥物則具有更高的特異性和有效性。轉(zhuǎn)染靶向PLK1的siRNAs后，各腫瘤細(xì)胞系包括乳腺癌細(xì)胞MCF-7、宮頸癌細(xì)胞HeLa?S3、結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480和肺癌細(xì)胞A549，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，而且在轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞中，中心體喪失聚合微管進(jìn)而形成紡錘體的能力。在原位膀胱癌的鼠模型上，應(yīng)用靶向PLK1的siRNA/陽離子脂質(zhì)體，能夠抑制膀胱癌的生長。

除了化學(xué)合成PLK1siRNA途徑外，還有載體介導(dǎo)的PLK1siRNA表達(dá)。但由于RNAi抑制基因表達(dá)的作用在很大程度上受到轉(zhuǎn)染效率的限制，提高轉(zhuǎn)染效率是一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，不但能感染分裂期的細(xì)胞并整合到其基因組中，而且還可以感染非分裂期的細(xì)胞。目前慢病毒作為siRNA載體使RNA干擾技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。

現(xiàn)有技術(shù)中未見報道慢病毒介導(dǎo)的靶向PLK1的siRNA在治療人類食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。??

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種針對人PLK1基因RNAi的重組慢病毒載體，能有效抑制食管鱗癌細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)，以及進(jìn)一步提供該重組慢病毒載體在治療食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。

本發(fā)明中有效抑制人食管鱗癌細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)的siRNA序列為：正義鏈：5'-GGGCGGCUUUGCCAAGUGCUtt-3'，反義鏈：5'-AGCACUUGGCAAAGCCGCCCtt-3'。

本發(fā)明首先根據(jù)siRNA序列設(shè)計原則從人PLK1的cDNA區(qū)域選取候選的siRNA序列，再通過BLAST同源比對保證候選siRNA序列對PLK1基因的特異性，最后選定2個針對PLK1?mRNA理論上可行的siRNA序列，詳細(xì)序列見表3中的siRNA-PLK1-1和siRNA-PLK1-2。siRNA-NC（上海吉凱基因）是作為陰性對照的siRNA。通過體外化學(xué)合成法合成PLK1?siRNA序列和陰性對照的正義鏈和反義鏈，然后正義鏈和反義鏈56℃退火形成雙鏈。將合成的PLK1?siRNA及陰性對照同時分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人食管鱗癌細(xì)胞，采用RT-PCR和Western?Blot的方法檢測PLK1?siRNA的干擾效率，確定高效的siRNA序列。該PLK1?siRNA序列瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人食管鱗癌細(xì)胞，通過TRANSWELL實驗，確定該序列能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力；通過劃痕愈合實驗，結(jié)果顯示該序列對食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力有明顯抑制作用；通過平板克隆實驗、軟瓊脂克隆形成實驗證實該序列能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞的體外惡性增殖；通過體外TUNEL實驗、流式細(xì)胞儀檢測說明該序列能誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。

根據(jù)該有效的siRNA序列，設(shè)計出人PLK1基因shRNA序列，詳細(xì)序列見表3中的shRNA-PLK1及陰性對照shRNA-NC。

根據(jù)上述的人PLK1基因shRNA序列，再結(jié)合載體特點合成其相應(yīng)的雙鏈DNA片段，詳細(xì)序列見表3中DNA-shRNA-PLK1及陰性對照DNA-shRNA-NC。