[發明專利]一種制備雞痘病毒抗體的方法

無效

• 申請號: 201210240395.3
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN102757493A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 張澍;呂宏亮;徐明偉;高斌戰
• 申請（專利權）人: 北京健翔和牧生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C07K16/06;G01N33/569
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種雞痘病毒抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）雞痘病毒的培養和粗制抗原的制備；

（2）粗制抗原的濃縮和純化；

（3）動物免疫及抗血清的制備：使用步驟（1）得到的粗制抗原制成初次免疫原進行初步免疫后，使用步驟（2）得到的純化抗原制成再次免疫原對動物進行再次免疫，分離得到抗血清；

（4）抗體的純化：抗體的純化包括抗體的初步純化和抗體的親和層析純化；

所述的初步純化是指抗血清中加入飽和硫酸銨，用膜封口冰上放置3-5h后，4℃離心，將上清移入到干凈的離心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃過夜透析；

所述的親和層析純化是將初步純化后的抗體與結合緩沖液充分混合，置4℃搖床平衡過夜后，加入到Sepharose4B層析柱上進行層析分離，用3倍體積的結合緩沖液充分洗滌后，再用10ml洗脫液洗脫收集；

所述的結合緩沖液為75mM?Tris，pH7.5；

所述的洗脫液為0.1M甘氨酸溶液，pH2.7;

（5）純化后的收集液立即加入pH8.8且含有5MNaCl的3M?Tris緩沖液中，調節pH至6.8~7.0。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1）中所述的粗制抗原的制備包括以下步驟：雞胚成纖維細胞長成單層后感染接種雞痘病毒4~5天后消化細胞，4℃以1500g離心10min，收取沉淀，用等滲緩沖液洗滌后，用含0.025%巰基乙醇、0.1%Triton-X100的低滲緩沖液溶解稀釋病毒，4℃以200g離心5min，去除細胞殘片和DNA，即得；

其中，所述的等滲緩沖液為含有10mM?NaCl，5mM?EDTA的10mM?Tris緩沖液，pH8.0；

其中，所述的低滲緩沖液為含有10mM?KCl，5mM?EDTA的10mM?Tris緩沖液，pH8.0。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中所述的抗原的濃縮是采用0.5~0.75μm膜盒式濾器或0.5~0.75μm中空纖維柱進行濃縮。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中所述的抗原的純化是采用密度梯度離心、Sepharose4Fast?Flow或Sepharose6Fast?Flow層析進行純化。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3）中初次免疫原的制備采用粗制抗原10mg/ml+弗氏完全佐劑，按體積比為1:1制成，再次免疫抗原采用純化抗原1mg/ml+弗氏不完全佐劑，按體積比為1:1乳化而成。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4）中所述的初步純化是指抗血清中加入飽和硫酸銨至終濃度50%，用膜封口冰上放置4h后，4℃以10000rpm離心30min，將上清移入到干凈的離心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃過夜透析，透析液體積應為抗體溶液體積的1000~1500倍。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4）中所述的Sepharose4B為偶聯了病毒抗原的CNBr活化的介質，其是按照以下方法制備得到的：稱取1~2gCNBr活化的介質Sepharose4B，用250~500ml的1mM?HCl洗滌、膨脹介質30min后，用10倍體積蒸餾水洗滌3次，用5~10ml的結合緩沖液洗滌后轉入病毒抗原進行偶聯，偶聯條件為1ml介質結合2mg純化病毒，加入0.1%的SDS進行變性后4℃過夜，用結合緩沖液洗去未結合抗原，pH8.0，0.2M甘氨酸液4℃封閉18h，用pH8.5結合緩沖液洗滌1次，用醋酸緩沖液洗滌4次，用于純化抗體或加入1M?NaCl在2~8℃備用。

8.按照權利要求1-7任一項所述的方法制備得到雞痘病毒抗體。

9.權利要求8所述的雞痘病毒抗體在制備檢測雞痘病毒感染試劑中的應用。