[發(fā)明專利]寡核苷酸引物對(duì)、寡核苷酸組合物和包括寡核苷酸組合物的試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210240201.X
• 申請(qǐng)日: 2012-07-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102747079A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊克禮;田永祥;段正贏;劉澤文;郭銳;周丹娜;袁芳艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種用于同時(shí)檢測(cè)PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的一步法RT-PCR檢測(cè)方法，也涉及寡核苷酸引物對(duì)、寡核苷酸組合物和包括寡核苷酸組合物的試劑盒，適用于臨床或科研中鑒別檢測(cè)樣品是否是PRRSV經(jīng)典株感染，或者是PRRSV高致病性變異株感染，或者是兩者的共同感染。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前、后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。1991年，荷蘭學(xué)者Wensvoort等人在感染豬體內(nèi)分離到歐洲型PRRSV，命名為L(zhǎng)elystad病毒(LV)；同年，美國(guó)學(xué)者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為VR-2332。目前，豬繁殖與呼吸綜合征已在世界范圍內(nèi)流行，我國(guó)自1996年以來(lái)普遍存在該病。2006年6月起，我國(guó)南方一些省份的豬場(chǎng)暴發(fā)了一種“高熱”綜合征，發(fā)病豬的體溫高于41℃，病豬食欲不振甚至廢絕，腹部、耳尖及后軀發(fā)紅，發(fā)病率達(dá)70%～100%，死亡率達(dá)50%～100%不等。該病傳播迅速，在短短的半年內(nèi)幾乎傳遍了大半個(gè)中國(guó)，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)的豬繁殖與呼吸障礙綜合征診斷方法有多種，如檢測(cè)病原的有病毒分離、免疫組化、免疫熒光試驗(yàn)等方法，檢測(cè)抗體的有ELISA、血清病毒中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫過(guò)氧化酶單層試驗(yàn)等血清學(xué)方法，但這些診斷方法不同程度地存在諸如敏感性低、特異性差、需時(shí)長(zhǎng)等的局限性。國(guó)內(nèi)外已建立了針對(duì)所有PRRSV的RT-PCR方法，但此種方法只能檢測(cè)是否有PRRSV感染，無(wú)法判斷是PRRSV經(jīng)典株感染，或者是PRRSV高致病性變異株感染，亦或是兩者共同感染。此外，已有的針對(duì)PRRSV高致病性變異株的RT-PCR檢測(cè)方法，只能檢測(cè)PRRSV高致病性變異株，無(wú)法判斷是單一的PRRSV高致病性變異株感染，還是PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的共同感染。由于上述各方法的局限性，無(wú)法為我國(guó)快速有效地監(jiān)控PRRS疫情提供有力的技術(shù)支持。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的鑒別檢測(cè)方法意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)而提出寡核苷酸引物對(duì)、寡核苷酸組合物和包括寡核苷酸組合物的試劑盒及其檢測(cè)方法，目的在于克服現(xiàn)有檢測(cè)PRRSV方法的不足，該方法只需要一對(duì)引物、一次檢測(cè)便能判斷檢測(cè)樣品中是否含有PRRSV經(jīng)典株，或者含有PRRSV高致病性變異株，亦或是兩者共同感染，該方法簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、敏感性高，并且可以同時(shí)進(jìn)行大批量的樣品檢測(cè)，可為PRRS疫情的監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查及防控提供有力的技術(shù)支持，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：寡核苷酸引物對(duì)，其特征在于由序列為T(mén)GAYGGGCGACAATGTCC的上游引物PRRSV?NSP2-F和序列為CGCAGACAAATCCAGAVG的下游引物PRRSV?NSP2-R組成。

用于同時(shí)檢測(cè)PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的寡核苷酸組合物，其特征在于包括如上所述的寡核苷酸引物對(duì)。

一種用于同時(shí)檢測(cè)PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的試劑盒，其特征在于包括如上所述的用于同時(shí)檢測(cè)PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的寡核苷酸組合物。

應(yīng)用權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)PRRSV經(jīng)典株與高致病性變異株的試劑盒進(jìn)行一步法RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將RT-PCR?50μL反應(yīng)體系在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行如下循環(huán)：45℃30min，94℃?5min，其擴(kuò)增條件為94℃?30?s，55℃?30?s，72℃?30?s；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72℃下延伸10?min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的RT-PCR?50μL反應(yīng)體系由5μL?10×?buffer，0.5μL?Taq?polymerase?(5U/μL)，0.5μL?reverse?transcriptase?(5U/μL)，0.5μL?RNase?inhibitor?(40U/μL)，4μL?RNA模板，5μL?dNTP?(10mM)，1μL?PRRSV?NSP2-F（100?μM），1μL?PRRSV?NSP2-R（100?μM）和32.5μL滅菌水組成；