[發(fā)明專利]一種基于分裂鎖式探針的多重RCA方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210237758.8
• 申請日: 2012-07-10
• 公開（公告）號: CN102719550A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 向陽;黃慶;府偉靈
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所 50211
• 代理人: 郭云

1.一種基于分裂鎖式探針的多重RCA方法，其特征在于：具體操作步驟為：步驟一、連接反應(yīng)：將靶序列DNA片段與終濃度為0.1μmol/L的四種分裂鎖式探針混合煮沸變性后，立即置于冰上冷卻5min，升溫至37℃，雜交15min，加入2.5U的T4DNA連接酶和1μL的T4DNA連接酶緩沖液，去離子水補(bǔ)足10uL反應(yīng)體系，連接反應(yīng)時(shí)間：45min，再加入10U?exonuclease?I和10Uexonuclease?III，37℃，反應(yīng)15min，制備出含有環(huán)狀模板的連接產(chǎn)物；其中T4DNA連接酶緩沖液的成份為40mmol/L?Tris-HCL,10mmol/L?MgCL₂,10mmol/L?DTT和0.5mmol/L?ATP；

步驟二、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)：取步驟一制得的混合連接產(chǎn)物10μL，與通用引物，其堿基序列如序列表序列10，混合煮沸變性后，分別加入摩爾濃度為的10mmol/LdNTP2μL，phi29DNA聚合酶10U，HhaI限制性內(nèi)切酶10U和由33mmol/Ltris-Ac、10mmol/LMgAC₂、6mmol/LKAC和0.1μg/μLBSA組成的緩沖液2μL，去離子水補(bǔ)足20uLRCA反應(yīng)體系，溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間60min；

步驟三、RCA單鏈DNA產(chǎn)物檢測：RCA反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳、RCA單鏈產(chǎn)物測序、熒光定量RCA擴(kuò)增或表面等離子體共振生物傳感器檢測方法中的一種方法進(jìn)行檢測。

2.如權(quán)利要求1所述的一種基于分裂鎖式探針的多重RCA方法，其特征在于：所述的分裂鎖式探針，包括以下4個(gè)部分：

1）檢測臂：探針的5′端和3′端為檢測臂，檢測臂與靶序列完全互補(bǔ)，只有當(dāng)與靶序列完全堿基互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，才可在連接酶作用下使探針兩端連接環(huán)化；

2）通用引物區(qū)：探針的引物結(jié)合區(qū)為滾環(huán)擴(kuò)增的通用引物區(qū)，實(shí)現(xiàn)混合靶序列的多重滾環(huán)擴(kuò)增；

3）酶切區(qū)域：探針右側(cè)的酶切區(qū)域包含一個(gè)硫代磷酸化的HhaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，生成的單鏈產(chǎn)物攜帶該位點(diǎn)，將在擴(kuò)增的同時(shí)被HhaI限制性內(nèi)切酶切成與環(huán)狀探針相同大小的單鏈DNA片段產(chǎn)物，而探針本身由于硫代磷酸化的保護(hù)而不會被酶切，從而始終作為模板進(jìn)行復(fù)制；

4）特異性標(biāo)簽序列：探針左側(cè)的標(biāo)簽序列區(qū)使RCA單鏈DNA產(chǎn)物帶有各自的特異性標(biāo)簽序列，可與芯片表面固定的互補(bǔ)標(biāo)簽序列探針特異性堿基互補(bǔ)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的特異性檢測。