[發明專利]氧化雙醛纖維素固定化脲酶的制備方法

無效

• 申請號: 201210237673.X
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102732500A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 郭明;燕冰宇;潘興祥;李銘慧
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及一種酶學技術，具體是以氧化雙醛纖維素為載體固定化脲酶的制備方法。

背景技術

脲酶在污水處理、釀酒以及醫療領域都具有很高的潛在價值。但是由于脲酶價格昂貴，溶液中的脲酶容易變性失活，反應后的脲酶難以回收，無法重復利用，極大地限制了脲酶的應用。為了提高脲酶在溶液中的穩定性，重復使用性和貯存穩定性，采用適當的方法將脲酶與載體鍵聯連接固定從而克服游離態脲酶的缺點，是一種可行的技術途徑。

目前脲酶的固定化載體材料選擇比較廣泛，主要分為無機材料和有機材料，其中有機材料包括聚合物(如改性聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇)、藻朊酸鹽和殼聚糖及其衍生物。纖維素、殼聚糖、淀粉等天然多糖類載體在自然界中大量存在，容易獲得，價格便宜，載體性能比較穩定，被廣泛應用于生活中的各個領域。但是由于此類載體缺少能與酶結合的功能基團，只能以吸附方法將酶固定在載體上，得到的固定化脲酶重復使用性能比較弱。

本發明以纖維素為原料，經化學改性，制備的氧化雙醛纖維素具有良好的生物相容性、生物可降解性、環境友好和無毒等特點，并具有纖維素不具有的活性功能基團，反應活性更強，是一種優良的載體材料。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種氧化雙醛纖維素固定化脲酶的制備方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案是：

本氧化雙醛纖維素固定化脲酶的制備方法是按如下步驟進行：

一、氧化雙醛纖維素的制備：

(1)纖維素的活化：將微晶纖維素或棉纖維置于質量比為12％-20％的NaOH水溶液中潤漲24h，用蒸餾水洗至中性，抽濾后將得到的固體置于30-40℃烘箱中干燥3h，研磨成粉末備用；

(2)纖維素的氧化：將活化后的微晶纖維素或棉纖維與1∶1-1∶4的重量比的高碘酸或高碘酸鈉置于水熱合成反應釜中，加入蒸餾水，填充系數為0.6-0.9，將此密閉的水熱合成反應釜置于110-130℃烘箱中反應4-10h；反應結束后，濾紙過濾得到固體，并用蒸餾水反復沖洗該固體4-5次，抽濾后將固體置于30-40℃烘箱干燥3h后研磨成粉備用；將干燥得到的產物再進行一次相同方法的選擇性氧化反應，即得氧化雙醛纖維素，再將氧化雙醛纖維素置于30-40℃烘箱中干燥3h后放入4℃冰箱中保存；

二、固定化脲酶的制備：

(1)分散相的制備：取步驟一(2)得到的氧化雙醛纖維素載體，加入pH4-10的磷酸鹽緩沖液制備分散相；控制氧化雙醛纖維素在此分散相中的質量比為3％-5％；

(2)脲酶的固定：向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液濃度為0.1-20mg/mL，控制反應溫度2-8℃，磁力攪拌2-4h；

(3)洗滌干燥：用紗布過濾得到固體，將此固體用去離子水洗滌4-5次，除去未固定的游離脲酶，真空冷凍干燥得到固定化的脲酶。

本發明的有益效果是：本發明采用水熱合成反應、利用密閉的壓力容器，以水為溶劑，氧化反應更充分，比傳統的方法獲得的氧化纖維素，其醛基含量較高，能為脲酶與載體的連接提供更多的活性結合位點。本方法的載體性能穩定、酶固定化的條件溫和，方法簡便。

具體實施方式

本發明結合實施例作進一步詳述：

脲酶是一種專一分解尿素的酶類，又名酰胺水解酶。在水存在的條件下，將尿素分解為氨和二氧化碳，是一般尿素分解反應(無脲酶催化)速度的10¹⁴倍。因此脲酶在污水處理、釀酒以及醫療領域都具有很高的潛在價值。但是由于脲酶價格昂貴，溶液中的脲酶容易變性失活，反應后的脲酶難以回收，無法重復利用，極大的限制了脲酶的應用。為了提高脲酶在溶液中的穩定性，重復使用性和貯存穩定性，可采用適當的方法將脲酶與合適的載體鍵聯連接固定從而很好的克服游離脲酶的缺點。脲酶的固定化載體材料選擇比較廣泛，纖維素、殼聚糖、淀粉等天然多糖類載體；聚乙烯，聚丙烯腈等聚合物載體；以及蠶絲素蛋白、磁性微球等其他新型載體均可作為脲酶的固載材料。優良的固定化載體材料應有化學性質穩定、親水性、具有一定剛性、機械穩定性、較大的表面積及抗微生物浸染等特點。