[發明專利]掃描共焦顯微術中的改進以及與之相關的改進

有效

• 申請號: 201210236769.4
• 申請日: 2007-09-14
• 公開（公告）號: CN102914861A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: R.A.霍爾特;G.R.西利
• 申請（專利權）人: 珀金埃爾默新加坡私人有限公司
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G02B26/08
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 劉金鳳;王忠忠

技術領域

本發明涉及掃描共焦顯微術，更特別地涉及對安裝在掃描共焦顯微系統中的樣本的一個或多個區域的選擇性照明（illustration）。

背景技術

共焦顯微鏡通常用于觀察半透明顯微物體的內部細節，特別是在生物應用中，其通常采用熒光照明。這種顯微鏡的基本特征是利用通過小孔（pinhole）聚焦的光照射樣本并且結合對通過相同小孔返回的光的觀察，結果是檢測到的光基本上與該小孔在樣本內的特定像平面相關，而不是與樣本上方或下方的平面相關。這樣能夠在該樣本內獲得準確的深度分辨率。通常，將激光器用于在小孔處提供非常緊聚焦的強光束。

如上所述，這種系統給出了有關該樣本中僅一個點的信息。然而，利用兩個可選的和全然不同的方法能夠擴展這種原理，從而提供該樣本的擴展像（image）。在第一種方法中，稱作‘掃描光斑（scanning?spot）’，在感興趣的區域上對小孔進行光學掃描，記錄返回的強度，以便重建樣本的像。在第二種方法中，平行照射許多小孔，以同時給出整個感興趣區域的信息。一種這樣的配置是‘Nipkow盤（disk）’，其中將小孔設置在盤中，然后使該盤旋轉以給出該區域的多次掃描的覆蓋。這種方法特別適合應用于對活細胞的高速成像，這是目前生物學中相當受關注的課題。然而，本發明與各種形式的共焦掃描有關，但尤其涉及采用多個小孔的共焦掃描。

一些已知的分析技術涉及向樣本的選定區域投送強光束，以便改變該選定區域中的樣本材料屬性。例如，在熒光顯微術中所使用的許多染料在暴露于非常強的光源時會‘漂白（bleach）’。

漂白特定的區域使該區域被‘標記’－使其與其他本來不可區分開的相鄰區域區分開，從而允許該區域在移動和顯影時被追蹤。這種‘光致漂白后的熒光恢復（Fluorescence?Recovery?After?Photobleaching）’（或者FRAP）允許細胞內的傳送機能被監視。通常，擴散過程將使漂白斑在一時間段之后恢復，該時間段是由擴散的速率決定的。對于粘性低的媒質，這一過程會非常快，在微秒數量級。

目標照射（targeted?illumination）的第二個實例是光催化（photoactivation）。一些染料在被非常強的光源催化時會改變其熒光色。同樣，這使某一區域被‘標記’并且允許傳送機能被研究。

掃描光斑共焦系統非常適于目標照射應用。單個掃描光斑覆蓋了樣本的所有部分，所以在光斑位于感興趣區域上方的同時提高激光功率產生了目標照射。盡管這種方法較慢且低效，但是一些年來目標照射已經可用在掃描光斑系統中。

然而，對于旋轉盤系統并非如此，其中光學裝置的平行照射無法顯著提高指定區域上的光強度。

發明內容

本發明提供了一種用于將光束輸入到從掃描共焦顯微系統的共焦掃描頭延伸到顯微鏡的光路中以照射安裝在顯微鏡中的樣本的選定區域的組件，其中所述組件包括：

－?光輸入端，用于接收來自光源的光束；

－?射束（beam）引導裝置，用于根據樣本的選定區域的形狀來控制光束的路徑；以及

－?射束耦合器，用于將光束選擇性地耦合到從共焦掃描頭到顯微鏡的光路中，其中由射束引導裝置來控制射束方向以便照射選定區域。

特別地，光束的強度可足以漂白樣本選定區域的熒光部分或者以其它方式改變其光學屬性，使得例如FRAP或者光催化實驗能夠進行。

該顯微系統的安排（其中來自該組件的光束被選擇性地輸入到共焦頭所使用的相同端口中）是有益的，因為這允許耦合（切換）裝置被設置在顯微鏡外。因此，能夠在無需進入顯微鏡內部或者無需在顯微鏡內容納附加部件的情況下實現本發明。

為了留有足夠空間供該組件插在共焦掃描頭與顯微鏡端口之間，該組件可以包括光中繼器（optical?relay），用以將在共焦掃描頭與顯微鏡之間的光路上形成的樣本像從該組件的顯微鏡側中繼（relay）到該組件的掃描共焦頭側。因此共焦掃描頭的工作基本上不會因引入該組件而受到影響。

優選的是，該光中繼器包括在光路中限定了孔的擋板（baffle），用以減少雜散光的透射（transmission）。

可以在射束耦合器與顯微鏡之間提供場鏡（field?lens）以會聚光束。

射束耦合器可以包括反射元件，該反射元件能被選擇性地插入在共焦掃描頭與顯微鏡之間的光路中，以促進透射的光束注射（inject）到光路中。反射元件可以采用反射鏡（mirror）的形式。有利的是，反射元件可以是分束器，以允許樣本在該組件的照射期間被觀察。