[發(fā)明專利]一種診斷綿羊肺腺瘤病毒的重組蛋白抗原及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210236741.0
• 申請(qǐng)日: 2012-07-10
• 公開（公告）號(hào): CN102702334A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張子群;宋銘忻;李巍;付麗君;韓彩霞;路義鑫;唐穎;彭永剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/15
• 分類號(hào): C07K14/15;G01N33/68;C12N15/70
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組蛋白抗原及其制備方法。

背景技術(shù)

綿羊肺腺瘤病(OPA)是由外源性的綿羊肺腺瘤病毒(exJSRV)引起的肺臟和支氣管上皮細(xì)胞的癌變，發(fā)病年齡是2月齡-11歲齡但以2-4歲齡為主，該病的特征性癥狀是在肺部產(chǎn)生大量的泡沫狀乳白色或粉紅的液體，當(dāng)羊低頭或“小推車”試驗(yàn)時(shí)液體從鼻孔流出，羊出現(xiàn)該臨床癥狀后在數(shù)日后死亡或在運(yùn)動(dòng)、寒冷刺激后突然死亡。OPA早在19世紀(jì)早期就已發(fā)現(xiàn)，但至今尚無(wú)有效阻止其傳播的方法，給許多國(guó)家的綿羊養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。

我國(guó)于1951年在蘭州首次發(fā)現(xiàn)，1958年傳入新疆，之后又傳播到內(nèi)蒙、青海等省份。由于沒有有效便捷的OPA實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，只能通過病理解剖和組織切片、免疫組化等方法確診，我國(guó)只有個(gè)別省市有OPA的流行病學(xué)記錄。

目前國(guó)內(nèi)外都未發(fā)現(xiàn)能讓該病毒在體外高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，也未分離到JSRV的純病毒，這給JSRV分子生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究及實(shí)驗(yàn)室診斷造成了很大的困難，關(guān)于OPA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法很少且多側(cè)重于PCR方法，ELISA檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外各有一篇相關(guān)報(bào)道。CA蛋白(衣殼蛋白)抗原性強(qiáng)且十分保守，在創(chuàng)建JSRV分子生物學(xué)檢測(cè)方法上具有很大的優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于CA蛋白表達(dá)方面的研究較少且表達(dá)技術(shù)不成熟，只針JSRV-NM株的1116-1664這548bp區(qū)段成功分段表達(dá)出CA蛋白，對(duì)該區(qū)段完整CA基因只表達(dá)出抗原性、免疫原性不強(qiáng)的截短蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種診斷綿羊肺腺瘤病毒的重組蛋白抗原及其制備方法，目的是表達(dá)出完整的未被截短的CA蛋白，提高抗原性。

本發(fā)明診斷綿羊肺腺瘤病毒的重組蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明診斷綿羊肺腺瘤病毒的重組蛋白抗原的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、提取自然感染OPA的綿羊的肺臟基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，獲得目的基因；二、將目的基因與pEASY?Simple?Cloning?Vector克隆載體進(jìn)行連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到trans5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行藍(lán)白篩選，次日，挑取白色單菌落接種到含0.1mg/mL?Amp的LB培養(yǎng)基中，于37℃振動(dòng)培養(yǎng)8h，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定；三、將鑒定正確的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a分別用限制性內(nèi)切酶EcoR?I和Xho?I進(jìn)行雙酶切，將酶切后的重組質(zhì)粒和酶切后的表達(dá)載體pET-28a用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到補(bǔ)充稀有密碼子的transetta感受態(tài)細(xì)胞中，次日，挑取單菌落接種在含0.05mg/mL?Kan的LB培養(yǎng)液中，于37℃振動(dòng)培養(yǎng)8h，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定；四、將鑒定正確的陽(yáng)性菌接種到LB培養(yǎng)基中，在37℃、185r/min搖床培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.6～0.8，然后向菌液中加入IPTG使IPTG終濃度為0.4mmol/L，再于30℃、185r/min誘導(dǎo)5h，然后于4℃、5000r/min離心15min，取沉淀，用PBS洗滌沉淀3次，洗完后用PBS溶解沉淀并進(jìn)行超聲處理，超聲結(jié)束后于4℃、10000r/min離心5min，吸取上清，然后用KCl染色切膠純化法進(jìn)行純化，即獲得重組蛋白；其中步驟一中PCR??擴(kuò)增所用上游引物FC??為5′-CCGGAATTCATGCCTGTCTTTGAAAATAACAACC-3′，下游引物RC為5′-CCGCTCGAGTTAAGCAATGCCTTGCATGTA-3′。

本發(fā)明根據(jù)GenBank上公布的內(nèi)蒙株JSRV(GenBank登錄號(hào)為DQ838494)的CA段選擇非跨膜、無(wú)信號(hào)肽及抗原性強(qiáng)的特意性區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，以自然感染OPA綿羊的肺臟DNA作模板通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段(1041-1700區(qū)段，共660bp)，并對(duì)該區(qū)段堿基進(jìn)行密碼子分析，結(jié)果該區(qū)段含有大量稀有密碼子，選擇補(bǔ)充了稀有密碼子的表達(dá)感受態(tài)進(jìn)行表達(dá)，得到了大小約28KD的蛋白，共220個(gè)氨基酸，并以以上清形式表達(dá)，為進(jìn)一步建立綿羊肺腺瘤病毒抗原的ELISA檢測(cè)方法及疫苗的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：