[發明專利]一種簡便快速檢測綿羊多胎基因BMPR-IB的試劑盒

有效

• 申請號: 201210236216.9
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102758016A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 劉武軍;邵勇鋼;王瓊
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

1.一種簡便快速檢測綿羊多胎基因BMPR-IB的試劑盒，其特征在于：利用試劑盒從羊毛毛囊中快速提取基因組DNA，并運用PCR-RFLP技術檢測BMPR-IB多胎基因A746G位點；

其中試劑盒包括：毛樣DNA提取液A和B，PCR擴增液、限制性內切酶Ava?II、10×Buffer?R、染料、ddH₂O、說明書；

（1）毛樣DNA提取液A為175mM的NaOH溶液；

（2）毛樣DNA提取液B為175mM的HCl?16.7μl，100mM的Tris-HCl、pH8.5、500μl，ddH₂O?483.3μl；

（3）PCR擴增液為2×Taq?PCR?MasterMix10.0μl，ddH₂O?7.7μl，10mM的上下游引物各0.4μl，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技術有限責任公司合成；上游引物序列：5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序列：5'CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；

（4）限制性內切酶Ava?II為10U/μl；

（5）10×Buffer?R為100mM?Tris-HCl，100mM?MgCl₂，1M?KCl，1mg/mlBSA；

（6）染料為6×RNA/DNA?Loading?buffer；

（7）ddH₂O；

（8）說明書；

其中對綿羊繁殖力基因的檢測：

（1）毛樣DNA的提取：取15-30根帶有毛囊的毛樣，用70％乙醇清洗2次，蒸餾水清洗2次，用消毒剪，剪切0.4cm根部毛樣，放入0.2ml離心管中離心，3500rpm、5-10s；加15μl毛樣DNA提取液A，漩渦混合離心，3500r?pm、5-10s；用熱循環程序實施熱循環：75℃1min，80℃?2min，85℃?1min，95℃1min，97℃?5min；從熱循環儀上取下，加入15μl毛樣DNA提取液B，漩渦混合，-20℃保存；經3500rpm、5-10s離心，取上清作為DNA模板，PCR擴增備用；

（2）PCR擴增：將1.5μl?DNA模板加入對應標號的PCR管中，再加入18.5μl?PCR擴增液，彈去氣泡，震蕩混勻，經3500rpm、5-10s離心；放入設定好程序的PCR儀中，反應程序為94℃預變性5min，94℃變性30s、60℃退火溫度30s、72℃延伸30s共30個循環，72℃延伸5min，4℃保存；用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測，電壓120V、電泳30min、EB染色，凝膠成像擴增產物符合預期片段140bp；

（3）PCR-RFLP檢測：酶切反應體系為ddH₂O2.5μl，10×Buffer?R2.0μl，限制性內切酶Ava?II?0.5μl，PCR擴增產物5.0μl；放入37℃恒溫箱消化4h；用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產物檢測，電壓120V、電泳30min、EB染色，凝膠成像系統成像，其基因判型結果：看不到30bp條帶，只見140bp、110bp條帶。

2.按照權利1所述的方法，其特征在于：所用三羥甲基氨基甲烷，即Tris-base，由莊盟生物提供；2×Taq?PCR?MasterMix由博邁德生物提供；限制性內切酶Ava?II、10×Buffer?R由MBI?Fermentas公司提供；6×RNA/DNA?Loadingbuffer由博邁德生物提供；ddH₂O由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供；DL2000DNA?Marker由莊盟生物提供；EB由天根生化科技有限公司提供；3-18K高速冷凍離心機產自SIGMA公司；JY04S凝膠成像儀產自北京君意東方電泳設備有限公司。