[發(fā)明專利]一種預防奶牛乳腺炎的改進型增效核酸疫苗的構建

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210236074.6
• 申請日: 2012-07-10
• 公開（公告）號: CN102847167A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設計）人: 蘇艷;王世民;張寶江
• 申請（專利權）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/085;C12N15/62;A61P15/14;A61P37/04
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

該發(fā)明涉及生物技術領域中的疫苗及其構建方法，尤其是涉及以地區(qū)流行菌株的FnBPA分子A區(qū)及B區(qū)的部分序列為靶標的DNA疫苗的改進及其構建方法。

背景技術

近年來，隨著飼養(yǎng)規(guī)模的擴大和飼養(yǎng)密度的增加，乳房炎的感染呈上升趨勢。截止2011年我國奶牛存欄頭數(shù)1300萬頭，每年由乳腺炎造成的經(jīng)濟損失可達40億元。近些年來，抗生素的大量使用甚至濫用，使金黃色葡菌球菌的抗菌譜逐漸擴大，給臨床治療和預防金黃色葡菌球菌乳腺炎提出了新的挑戰(zhàn)。目前認為疫苗是防控金黃色葡菌球菌感染的有效方法。迄今金黃色葡萄球菌疫苗研制經(jīng)歷了全菌滅活苗、亞單位疫苗和DNA疫苗3次重大變革。

林峰強等(林峰強，胡松華，胡奇林，等.奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎菌苗佐劑研究現(xiàn)狀.動物醫(yī)學進展，2004，25(6)：49-51.)針對滅活苗的不足研制出了針對金黃色葡萄球菌單一成分的亞單位疫苗。

金黃色葡萄球菌黏附素纖連蛋白結合蛋白A(FnbpA)是細菌感染的先決條件(周宏，李韓平.金黃色葡萄球菌表面蛋白研究進展.生物技術通訊，2004，15(1)：73-75.)抑制其活性后可從根源上切斷金黃色葡萄球菌感染的途徑。幾乎所有的金黃色葡萄球菌都擁有FnbpA基因，都可以表達纖連蛋白結合蛋白A，此蛋白由于具有與宿主組織的特異黏附能力，正成為抗金黃色葡萄球菌感染疫苗開發(fā)的熱點分子。目前FnBP分子結構中的D區(qū)被稱作配體結合區(qū)，被認為是主要的免疫優(yōu)勢表位，目前在研制金黃色葡萄球菌疫苗中占有重要的作用。

國內(nèi)研制的FnBPA重組蛋白疫苗疫苗首免后7d，在免疫組小鼠血清中即可檢測到抗體，而且隨著免疫時間的延長，抗體效價呈明顯的上升趨勢，在21d達到最高水平，之后抗體水平逐漸降低。通過對小鼠的免疫攻毒試驗可知，F(xiàn)nBPA基因工程亞單位疫苗可有效提高小鼠的抗體水平，免疫保護指數(shù)PI達80％，說明該疫苗對金黃色葡萄球菌具有較強的免疫保護力(張海燕，楊宏軍，王長法，何洪彬，仲躋峰，馬衛(wèi)明.重組金黃色葡萄球菌FnbpA亞單位疫苗的研制.西北農(nóng)林科技大學學報.2011，5(39)：39-43.)。

雖然基因工程亞單位疫苗具有抗原劑量大、純度高且無遺傳物質及宿主和培養(yǎng)基的成分等優(yōu)點(張延齡，張暉.疫苗學.北京：科學出版社2004：345-377，421-504.)基因工程亞單位疫苗誘導大動物的免疫應答持續(xù)時間短，且制作的成本高，尤其是大動物的免疫成本高。

為克服這些缺點，我們選擇了核酸疫苗。核酸疫苗又稱基因疫苗、DNA疫苗，是把外源基因克隆到質粒或病毒載體上，用重組質粒或病毒DNA直接免疫，使外源基因在活體內(nèi)以天然蛋白的形式呈遞抗原，激活機體免疫系統(tǒng)，并能持續(xù)的引發(fā)免疫反應。其無毒性返祖現(xiàn)象，對病毒變異株也起作用。因此DNA疫苗是近年來備受人們關注的一種新型疫苗。基于細菌表面蛋白的粘附機制研制的抗金黃色葡萄球菌核酸疫苗，被認為是有廣闊研究前景的疫苗，可望通過阻斷金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺上皮細胞的粘附過程來預防乳腺炎的發(fā)生。

Nour等研制了CTLA4和ClfA的重組核酸疫苗并采用了共聚物陽離子包裝先用核酸疫苗免疫奶牛2次，3個月后再用200μg的ClfA重組蛋白加強免疫一次，免疫牛產(chǎn)生了較強的體液免疫及細胞免疫反應(Adel?NM?Nour?Eldin，Lulzim?Shkreta，Br?Ian?G?Talbot，et?a.l?DNAimunization?of?dairy?cows?with?the?clumping?factor?A?of?Staphylococcus?aureus.Vaccine，2006，24：1997-2006.)國外已有基于FnBP的黏附機制來研制金黃色葡萄球菌DNA疫苗的報道。

但是當前以FnBPA為靶基因研制的核酸疫苗效果并不是很理想，作為新一代疫苗的代表，免疫原性較低是限制DNA疫苗廣泛應用的一個主要因素。尤其是大動物要獲得有效的免疫需要大劑量的DNA。提高DNA疫苗的有效性可通過改善所使用的質粒的抗原提呈效率使其在體內(nèi)更有效的發(fā)揮免疫效果來實現(xiàn)。