[發明專利]一種檢測副豬嗜血桿菌的可視化環介導等溫擴增試劑盒

無效

• 申請號: 201210234349.2
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102776283A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 車勇良;周倫江;陳如敬;王隆柏;莊向生;江斌;吳學敏;劉玉濤
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/21
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種檢測副豬嗜血桿菌的可視化環介導等溫擴增試劑盒。

背景技術

?副豬嗜血桿菌（Haemophilus?parasuis，Hps）是革拉澤氏病（Galasser’s?disease）的病原菌，是健康豬上呼吸道的常在菌，在機體受應激或感染導致免疫力下降時引起保育仔豬及青年豬發生纖維素性多發性漿膜炎。近年來，豬圓環病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性疾病常繼發Hps感染而增加發病率和死亡率，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。

副豬嗜血桿菌的血清型眾多，有15個血清型和20%以上未能定型菌株，其中血清1、5、10、12、13和14型為強毒力血清型，血清2、4、15型為中等毒力血清型，血清3、6、7、8、9和11型為無毒力血清型。且各血清型之間交叉保護力弱，疫苗的免疫效果大打折扣，從而更加重了副豬嗜血桿菌的流行，造成更大的損失。因此，迫切需要建立副豬嗜血桿菌的快速診斷技術，為我國副豬嗜血桿菌病的防控提供必要的技術支撐。

?肽聚糖相關脂蛋白（PalA）是細胞膜脂蛋白與肽聚糖相互作用的一類蛋白，其廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中。PalA蛋白在維持細胞外膜的完整性和細菌的致病性方面都起著重要的作用。并且，palA基因在副豬嗜血桿菌中是比較保守的，可以作為副豬嗜血桿菌的診斷基因。

目前已有檢測副豬嗜血桿菌的多種方法報道，如檢測病原的細菌分離、免疫組化、寡核苷酸特異性捕獲圓盤雜交（OSCPH）實驗以及根據副豬嗜血桿菌16S?rRNA序列設計引物建立的PCR方法；并且還有抗體的血清學診斷方法，如補體結合實驗（CF）、間接血凝試驗（IHA）和間接ELISA方法。但這些方法在成本、敏感度、操作的方便性上存在一定的缺陷，限制了它們在生產中的實際應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于環介導等溫擴增（Loop-mediated?isothermal?amplification,?LAMP）技術的快速檢測副豬嗜血桿菌（Haemophilus?parasuis,?Hps）的試劑盒。

本發明提供的副豬嗜血桿菌檢測試劑盒，包括針對副豬嗜血桿菌肽聚糖相關脂蛋白（Peptidoglycan-associated?lipoprotein,?PalA）基因的保守區的三對引物，一對引物是與序列表中的序列1結合的內測引物對，一對引物是與序列表中的序列1結合的外測引物對，一對引物是與序列表中的序列1結合的環形引物對。

???所述序列1為?Hps?palA基因的序列：

ATGAAAAAACTAGCTAAAGTTTTAATGATTGCGGCACCAGCTTTCGTTTTGGCAGCATGTAGCAGCTCAAACGACAATGCAAGTGCTAATGCAAGTGCTAATGCAGGTCAAACATTCGGTGGTATGTCTGTTCAAGATTTACAAACCCGTTACAACACTGTATATTTTGATTTCGACAGCTACACACTAAAAGCTGAAGATCAACAACTTTTAGATGCACACGCACAATACTTAGTTGCATCTAAAGGCAAAGTAACTGTTGCAGGTCACGCTGATGAGCGTGGTACTCCAGAGTACAACATCGCCTTAGGTCAACGTCGTGCTGACGCAGTTAAAGATTTTTTAGCAACTAAAGGTGCTAGCAACGTGGCAACAGTTTCTTACGGTGAAGAAAAACCAGCAGTATTAGGTCACTCAGAAGCTGATTACTCTAAAAACCGTCGTGCAGTGTTAGAGTACTAA

所述內測引物對包括上游引物（FIP）和下游引物（BIP），所述外測引物對包括上游引物（F3）和下游引物（B3），所述環形引物對包括上游引物對（LF）和下游引物（LB）。其中各引物的序列分別為：

FIP：TTAACTGCGTCAGCACGACGGATGAGCGTGGTACTCCA

BIP：GCAACGTGGCAACAGTTTCTAGTAATCAGCTTCTGAGTGAC

F3：AGTAACTGTTGCAGGTCAC

B3：TGTGTCTTAGTACTCTAACACTG

LF：TGACCTAAGGCGATGTTGTACTC

LB：CGGTGAAGAAAAACCAGCAGTAT