[發(fā)明專利]藍(lán)藻中熒光恢復(fù)蛋白的表達(dá)純化及其晶體結(jié)構(gòu)

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201210233832.9
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN103275199A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周紅剛;劉婷;楊誠;婁智勇;董輝;郭宇;王權(quán);傅晟;宋洋
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院;南開大學(xué)
• 主分類號: C07K14/405
• 分類號: C07K14/405;C12N15/63;C07K1/14;C12N15/70
• 代理公司: 北京德恒律治知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11409
• 代理人: 章社杲;孫征

1.一種藍(lán)藻中的熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）為藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的第26位到第134位的編碼基因，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐標(biāo)，或者藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40％氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表1?中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于1.7埃。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述藍(lán)藻為藍(lán)細(xì)胞PCC?6803。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述的晶體具有P4(1)2(1)2的空間群，晶胞參數(shù)為約：a=b=87埃，c=226埃，α=β=γ=90°。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中所述藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體結(jié)構(gòu)在一個晶體學(xué)不對稱單位內(nèi)有6個蛋白分子，其中共存在兩種三維構(gòu)象，第一種構(gòu)象由5個α螺旋組成，其中α螺旋1包括第36位Gln到?第67位的氨基酸區(qū)段，α螺旋2包括第71位Ile到第91位Lys的氨基酸區(qū)段，α螺旋3包括第99位Ile到第Glu位氨基酸區(qū)段，α螺旋4包括第114位Ala到第118位Thr的氨基酸區(qū)段，α螺旋5包括第122位Ala到第133位Arg氨基酸區(qū)段。第二種構(gòu)象由4個α螺旋組成，其中α螺旋1包括第36位Gln到第82位Ser氨基酸區(qū)段，α螺旋2包括第95位Arg到第108位Glu氨基酸區(qū)段，α螺旋3包括第113位Ala到第118位Thr氨基酸區(qū)段，α螺旋4包括第122位Ala到第133位Arg氨基酸區(qū)段，其中藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的第一種構(gòu)象如圖1（A），第二種構(gòu)象如圖1（B）。

5.構(gòu)建高效表達(dá)藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的方法，對藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）全長基因進(jìn)行截短，獲得表達(dá)量大的重組載體，優(yōu)選地對氨基端進(jìn)行了10-30位的截短，更優(yōu)選地截去氨基端前26位。

6.表達(dá)和純化藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的方法，包括:

(a)構(gòu)建融合了標(biāo)簽蛋白基因的編碼藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）基因序列的載體，將重組載體轉(zhuǎn)化入原核或真核細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)帶有標(biāo)簽蛋白的藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）；

(b)將（a）獲得的FRP蛋白通過特異性的與所述特異標(biāo)簽識別的方法分離出所述目的蛋白，經(jīng)過Thrombin蛋白酶在4-30攝氏度酶切過夜，優(yōu)選地使用4-10攝氏度，進(jìn)一步將蛋白經(jīng)過一系列親和層析柱的方法進(jìn)行純化，通過丙烯酰胺凝膠的方法檢測蛋白質(zhì)純度，得到純度較高的FRP蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)純化藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的方法，其中所述標(biāo)簽蛋白選自His、GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、特異性抗體，優(yōu)選地使用His標(biāo)簽，所述載體含有卡那霉素選擇性標(biāo)記基因；步驟（b）所述的過親和層析柱，優(yōu)選地使用Resource?Q離子交換層析（GE）和凝膠排阻層析(GE)，更優(yōu)選地將通過Resource?Q離子交換層析之后的蛋白質(zhì)再一次反掛Ni-NTA親和層析柱，其中反掛Ni-NTA親和層析柱時，優(yōu)選地補(bǔ)充加入NaCl至終濃度300-500Mm。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)純化藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的方法，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。

9.結(jié)晶藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的方法，包括：

(a)將表達(dá)純化好的藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）蛋白濃縮至濃度約為15－30mg/mL；

(b)用氣相懸滴法或坐滴法篩選晶體生長條件；

(c)通過seeding等方法對蛋白晶體進(jìn)行優(yōu)化，獲得藍(lán)藻熒光恢復(fù)蛋白（FRP）的晶體。

10.表達(dá)和純化硒代蛋白質(zhì)FRP的方法，包括：

(a)通過將FRP中的亮氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔瑯?gòu)建表達(dá)硒代蛋白質(zhì)載體的方法；

(b)運(yùn)用大腸桿菌的BL21（DE3）表達(dá)硒代蛋白；

(c)將獲得的蛋白通過特異性的與所述特異標(biāo)簽識別的方法分離出所述目的蛋白，經(jīng)過Thrombin蛋白酶在4-30攝氏度酶切過夜，在將蛋白經(jīng)過Resource?Q離子交換層析（GE），反掛Ni-NTA親和層析柱，凝膠排阻層析(GE)，得到純化好的FRP蛋白。