[發明專利]一種人心肌脂肪酸結合蛋白酶促化學發光免疫檢測方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201210233784.3
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102735849A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 唐磊;朱琳琳;孫旭東;楊曉林;吳曉東
• 申請（專利權）人: 北京源德生物醫學工程有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;姜義民

技術領域

本發明屬于免疫檢測分析技術領域，具體提供了一種人心肌脂肪酸結合蛋白酶促化學發光免疫檢測方法和試劑盒，適用于人心肌脂肪酸結合蛋白的酶促化學發光檢測分析。

背景技術

人心肌脂肪酸結合蛋白（FABP）是一種重要的細胞內脂肪酸結合蛋白。其分子量較小為15kD的胞漿蛋白，大量存在于心肌組織中，其在心肌中的含量比骨骼肌高10倍，在腎、肝、小腸含量很低。它在心肌細胞內干預游離脂肪酸的細胞內運輸，提供心肌細胞能量。心肌缺血導致心肌細胞壞死，h-FABP從心肌細胞滲漏到血液中，從而使外周血的h-FABP上升。AMI出現后6h內血中升高的生化標志物為早期標志物，h-FABP在AMI發生后1～2h立即升高，并持續至12h，保持較高水平和較高的敏感性，在24h左右恢復并接近正常水平，成為理想的診斷AMI的早期生化標志物。

目前人心肌脂肪酸結合蛋白的檢測方法主要有酶聯免疫吸附實驗（Enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA）和膠體金免疫層析法（Gold-immunochromatography?assay，GICA）。ELISA方法具有操作簡單、技術可靠、試劑方便易得等優點，但其敏感性、特異性不夠高，作為定量方法不夠準確；GICA方法簡便、快速、可單份或成批測定,但其靈敏度更低于ELISA方法，而且通常情況下只能做為定性方法，而不能作為定量方法。

化學發光(ChemiLuminescence，簡稱為CL)分析法是分子發光光譜分析法中的一類，其原理是在化學反應中生成的不穩定的激發態中間體，當其回到基態時，釋放光子。化學發光分析法主要是依據化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。在免疫檢測分析中，使用化學發光技術，可以使檢測的范圍達到6個數量級，而且靈敏度很高，達10^-18摩爾水平，加上標記物穩定，有效期長，使其受到越來越多的關注與應用。

但目前尚沒有利用化學發光分析法測量人心肌脂肪酸結合蛋白的研究和應用。

發明內容

為了進一步提高人心肌脂肪酸結合蛋白檢測的敏感性、特異性和準確度，發明人將酶促化學發光分析方法應用于人心肌脂肪酸結合蛋白的檢測中，經過大量的實驗，摸索出一種靈敏、準確且穩定的檢測方法，由此完成了本發明。

本發明一個方面涉及一種人心肌脂肪酸結合蛋白檢測方法，其包括以下步驟：

（1）將固相化抗人心肌脂肪酸結合蛋白抗體固定在固相表面，加入待測樣本和標記的抗人心肌脂肪酸結合蛋白抗體，溫育，然后用洗滌液洗滌；任選地，同時設立人心肌脂肪酸結合蛋白標準品的對照；

（2）加入化學發光底物工作液，放置一段時間；

（3）測量發光值，得到待測樣本的人心肌脂肪酸結合蛋白濃度值。

其中步驟（1）中的溫育為，在18-42℃條件下，優選為20-37℃條件下，溫育5-120min，優選為溫育10-60min，更優選為15-45min，在本發明的一個實施方案中，在37℃條件下，溫育30min。

其中步驟（2）中的放置放一段時間是指1-30min,優選為2-20min。在本發明的一個實施方案中，放置時間為5min。

具體地，檢測方法如下：

1．在固定有抗人心肌脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的聚苯乙烯微孔板中加入5-100μL血清或血漿樣本，標準品，混勻；加入5-100μL辣根過氧化物酶標記的抗人心肌脂肪酸結合蛋白單克隆抗體，37℃溫育10-60分鐘。在本發明的一個實施方案中，溫育30min。

2．洗滌：可采用手工洗滌或洗板機洗滌。手工操作方法為：直接排除包被板中的液體，并加入洗滌液（300μL/孔），倒出洗滌液并拍擊以除去掛壁液體，重復三次，洗板機操作見儀器說明書。

3．加入化學發光底物工作液：每孔加入50-400μL，所述發光底物工作液包括底物溶液、輔助發光溶液和反應增強劑。混勻后2-20分鐘測量。

4.讀取發光值：在發光測定儀上測定每孔的發光值。

本發明的另一方面涉及人心肌脂肪酸結合蛋白檢測試劑盒，其包括：連接有抗人心肌脂肪酸結合蛋白抗體的微孔板，標記的抗人心肌脂肪酸結合蛋白抗體和化學發光底物工作液。

在本發明中，所述化學發光底物工作液包括底物溶液、輔助發光溶液和反應增強劑。

在本發明中，所述試劑盒還可以包括洗滌液，人心肌脂肪酸結合蛋白標準品和質量控制血清。