[發明專利]一種增加測序讀長的測序方法

有效

• 申請號: 201210232676.4
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN102766689A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種增加測序讀長的測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.將第一錨定引物結合于待測核酸片段上的第一接頭上；

B.在第一錨定引物延伸末端分別連接帶不同位置標記的熒光探針，并檢測相應連接產物的熒光信號，得到第一錨定引物延伸末端后M個核苷酸的序列信息；

C.利用內切酶將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有含有待測序片段的酶切產物；

D.酶切產物連接第二接頭得到新待測核酸片段，將第二錨定引物結合于新待測核酸片段的第二接頭上；

E.在第二錨定引物延伸末端分別連接帶不同位置標記的熒光探針，并檢測相應連接產物的熒光信號，得到第二錨定引物延伸末端后N個核苷酸的序列信息；

F.更換內切酶、接頭、錨定引物和熒光探針，對前一步驟的產物進行酶切、接頭連接、錨定引物結合、熒光探針連接和熒光信號檢測；

G.重復步驟F，直至得到待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息；

其中，M、N均為正整數；所述待測核酸片段含有營養指導基因序列、常規藥物相關基因序列或易感基因序列。

2.根據權利要求1所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A中所述待測核酸片段固定于固相載體表面。

3.根據權利要求2所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，在步驟A之前還包括步驟：

A0.利用固相載體對源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。

4.根據權利要求3所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟A0包括以下步驟：

A01.將用于擴增的源核酸固定于固相載體表面，得到表面帶有含有至少一個核酸片段的固相載體；

A02.將引物結合于固相載體表面上的引物結合位點，得到固定有引物的擴增載體；

A03.對擴增載體上的源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。

5.根據權利要求4所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A02中所述引物包括用于對所述源核酸進行擴增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是與源核酸5’端互補結合的核酸序列，所述下游引物是與源核酸3’端序列相同的核酸序列。

6.根據權利要求4所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A03中所述的擴增是單分子擴增。

7.根據權利要求4所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟A02中引物結合于固相載體表面的方式為：

引物與固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現直接結合；

或通過連接子攜帶的基團分別與引物和固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現間接結合。

8.根據權利要求7所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述配對連接的方式采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/碘乙酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一種。

9.根據權利要求1所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A中所述第一錨定引物帶有含有至少一個酶切識別位點。

10.根據權利要求9所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟C包括以下步驟：

C1.將步驟B中連接的熒光探針與第一錨定引物洗脫，重置第一錨定引物并進行鏈延伸，與待測核酸片段形成雙鏈核酸分子；

C2.內切酶通過識別第一錨定引物上所帶的酶切識別位點并進行酶切，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產物。

11.根據權利要求1所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟C包括以下步驟：

C1’.在第一錨定引物的另一端連接雙鏈的接頭三，該接頭三帶有含有至少一個酶切識別位點；

C2’.利用內切酶識別接頭三所帶的酶切識別位點，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產物。

12.根據權利要求1至11中任一項所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述第一錨定引物帶有含有至少一個特異性殘基和/或一端是封閉的。