[發明專利]新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白及其制備和應用

有效

• 申請號: 201210232101.2
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102702360A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 吳雪瓊;陽幼榮;梁艷;趙衛國;馮金棟;張俊仙
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇九醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;G01N33/68;C12R1/32
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 劉徐紅

1.一種新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白，其由Rv0057和Rv1352兩種蛋白的抗原表位依次連接構成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv1352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.根據權利要求1所述的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白，其特征在于：所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。

3.權利要求1或2所述的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

（1）分析結核分枝桿菌Rv0057、Rv1352的基因序列和蛋白質結構，確定兩個蛋白抗原表位融合的區域、組合和順序；依次將Rv0057和Rv1352蛋白抗原表位連接，形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端；

（2）兩個蛋白融合的克隆：

①在Rv0057上游引物添加Nhe?I酶切位點，在Rv0057下游引物添加編碼3個疏水性氨基酸的DNA序列和Spe?I、Xho?I酶切位點，將PCR擴增產物用Nhe?I和Xho?I雙酶切后，插入用Nhe?I和Xho?I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中；轉化到大腸桿菌DH5α受體菌中；經過質粒提取，經T7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057/pET30aSETB；

②在Rv1352上游引物添加Nhe?I酶切位點和編碼1個疏水性氨基酸的DNA序列，在Rv1352下游引物添加Spe?I、Xho?I酶切位點，將PCR擴增產物用Nhe?I和Xho?I雙酶切后，插入用Nhe?I和Xho?I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中；轉化到大腸桿菌DH5α受體菌中；經過質粒提取，經T7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv1352/pET30aSETB；

③用Spe?I和Xho?I雙酶切Rv0057/pET30aSETB質粒作為載體；用Nhe?I和XhoI雙酶切Rv1352/pET30aSETB質粒，獲得的Rv1352片段插入Rv0057/pET30aSETB質粒載體中；轉化到大腸桿菌BL21（DE3）受體菌中；經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB，并使Rv0057蛋白抗原表位與Rv1352蛋白抗原表位之間通過連接臂相聯接。

4.權利要求1或2所述的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白在制備結核抗體診斷試劑盒中的應用。