[發明專利]miR-202實時熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201210231259.8
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102732632A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 鞠少卿;申嫻娟;王旭東;張霞;施維;戚菁;吳信華;郭益冰;李曉紅;陸晶晶
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南通市永通專利事務所 32100
• 代理人: 葛雷

1.一種miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是：包括下列步驟：

（1）外周血中單個核細胞的分離：

取新鮮血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴細胞分離液，加入到15ml錐形離心管中，淋巴細胞分離液與血液的重量比為1:2；再將血液沿管壁鋪到淋巴細胞分離液上面，2000r/min下離心20min，取血漿層與分層液交界處渾濁的富含單個核細胞的灰白層，用生理鹽水洗滌2次，1500r/min離心10min，最后棄去上清，得分離的外周血中單個核細胞，-80℃冰箱保存；

（2）細胞中總RNA的提取

取分離的外周血中單個核細胞5×10⁶個，加入1ml?Trizol，混勻，室溫靜置5min；加入0.2ml氯仿，振蕩15sec，室溫靜置2min；4℃離心，12000r/min?15min，吸取上清至另一個1.5ml離心管中；加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫靜置10min；4℃離心，12000r/min?10min，吸棄上清；加入1ml?75％乙醇，洗滌沉淀，4℃離心，7500r/min?5min，吸棄上清；晾干，加入20μl0.1％焦碳酸二乙酯H₂O溶解，采用紫外分光光度計檢測RNA溶液濃度及純度，取A260/A280在1.8～2.1用于實驗；

（3）逆轉錄合成cDNA反應體系：

用RNA?template?2μg，RT?Primer?2μl，ddH₂O補足至11μl，混勻離心，70℃放置10min，冰育2min，再加入以下試劑：RT?buffer5×5μl，dNTP?mix?2μl，40U/μl的RNase?inhibitor0.5μl，200U/μl的RT酶0.5μl，ddH₂O補足至25μl，混勻，42℃?60min，70℃?10min；合成得到的cDNA放-80℃冰箱保存備用；

（4）熒光定量PCR擴增檢測：

反應體系：MaximaTM?SYBR?Green/ROX?qPCR?Master?Mix（2×）22.5μl，正反向5μM的Bulge-LoopTM?miRNA?Primer各5μl，RT-PCR產物2μl，RNase-free?H₂O補足至50μl；95℃預變性20sec，1個循環；95℃?10sec，60℃?20sec，70℃?31sec，40個循環；每管設立三個復孔；整個熒光定量PCR擴增反應過程冰上操作。

2.根據權利要求1所述的miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是：步驟（4）后，還經下列步驟：

（5）熒光定量PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。

3.根據權利要求1所述的miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是：步驟（2）中加入0.1％DEPC?H₂O溶解是在65℃下促溶10～15min。